李麗麗　鄭敏　楊洪一

摘 要： 利用CTAB法分離辣椒葉片總RNA，利用RT-PCR技術(shù)擴增出了辣椒輕斑駁病毒中國分離物Hrb基因組不同區(qū)域片段。并經(jīng)克隆、測序，證明其為辣椒輕斑駁病毒特異序列。經(jīng)序列拼接，獲得了6 290 nt的辣椒輕斑駁病毒中國分離物Hrb基因組全序列;該序列與GenBank中已報道的其他辣椒輕斑駁病毒基因組的序列同源性為94.0%～99.6%。系統(tǒng)進化分析顯示辣椒輕斑駁病毒中國分離物Hrb與日本分離物（PMMoV-J、C-1421、Pa18、TPO-2-19）親緣關(guān)系較近，與西班牙分離物Ia親緣關(guān)系較遠。

關(guān)鍵詞： 辣椒;辣椒輕斑駁病毒;基因組

中圖分類號：S641.3? ? 文獻標志碼：A? ? 文章編號：1673-2871（2020）06-012-05

Abstract： Total RNA was isolated from leaves of pepper using CTAB method. The fragments located in different regions of a Chinese isolate of Pepper mild mottle virus （PMMoV） were amplified by RT-PCR， and the PMMoV-specific fragments were confirmed by cloning and sequencing. A 6290 nt genome sequence of Chinese isolate Hrb was obtained. The identities between the sequence and other reported sequences in GenBank were 94.0%-99.6%. Phylogenetic analysis indicated that there was close genetic relationship between isolate Hrb with Japan isolates （PMMoV-J， C-1421， Pa18， and TPO-2-19）. In addition， there was far genetic relationship between isolate Hrb with Spanish isolate Ia.

Key words： Pepper; Pepper mild mottle virus; Genome

辣椒輕斑駁病毒（Pepper mild mottle virus，PMMoV）是當前辣椒生產(chǎn)中遇到的主要病毒之一[1]。辣椒輕斑駁病毒屬煙草花葉病毒屬（Tobamovirus），病毒粒體呈直桿狀。辣椒輕斑駁病毒曾在英國、美國辣椒田中引起毀滅性災(zāi)害，目前該病毒已在美國、德國、日本等地廣泛發(fā)生，并在世界各地廣泛分布[2]。向本春等[3]于1994年在新疆辣椒上發(fā)現(xiàn)了辣椒輕斑駁病毒，是我國的首次報道。此后，相繼在青島、北京等地廣泛被報道[4]。辣椒輕斑駁病毒為種傳病毒，帶毒種子是病毒擴散的重要因素。辣椒輕斑駁病毒可隨辣椒制品進入人體，經(jīng)消化、排出體外后仍具有侵染性[5]。早期侵染后，辣椒輕斑駁病毒可使葉片輕度褪綠，部分植株矮化，癥狀可能較輕微;后期可能使葉片斑駁、黃化，可使辣椒果實呈現(xiàn)凹凸、壞死斑點或淺黃色斑駁，從而影響辣椒產(chǎn)量及品質(zhì)[1]。

辣椒輕斑駁病毒對辣椒生產(chǎn)造成了巨大威脅，因而迫切需要控制辣椒輕斑駁病毒造成的危害。培育抗病毒品種是控制植物病毒病危害的主要策略，當前已獲得了辣椒輕斑駁病毒的抗性基因[6]。然而，由于病毒的快速變異，一些新的病毒分離物可能使抗性基因失效[7-9]。獲得病毒不同分離物的基因組序列并分析其分子變異特點是病毒防控的基礎(chǔ)性工作。筆者在前期研究中已獲得了一個辣椒輕斑駁病毒中國分離物，在本試驗中探索獲得其基因組序列并分析其分子變異特點。

1 材料與方法

1.1 材料

感染辣椒輕斑駁病毒的辣椒植株于2014年取自哈爾濱農(nóng)田，經(jīng)RT-PCR鑒定其為辣椒輕斑駁病毒。該分離物被命名為Hrb。

基于辣椒輕斑駁病毒基因組序列（GenBank登陸號：NC_003630）設(shè)計引物。引物序列見表1，引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 總RNA分離

向離心管中加入490 μL CTAB、10 μL β-巰基乙醇。采集幼嫩葉片，經(jīng)液氮速凍，快速研磨至細粉，并轉(zhuǎn)入離心管。輕輕晃動離心管，65 ℃水浴，之后加入等體積的氯仿/異戊醇（24∶1）混勻后12 000 r·min-1離心5 min。取上清，再次進行氯仿/異戊醇抽提、12 000 r·min-1離心5 min。取上清并加入1/10體積3 mol·L-1醋酸鈉、三倍體積無水乙醇，混勻后12 000 r·min-1離心5 min。加入30 μL去離子水溶解沉淀。

1.3 利用RT-PCR技術(shù)擴增病毒基因組不同區(qū)域片段

反轉(zhuǎn)錄體系如下：總RNA 1.0 μL，RNase free H2O 12 μL，M-MLV Buffer 4 μL，隨機引物1.0 μL，dNTPs 0.5 μL（10 mmol·L-1），RNasin Ribonuclease Inhibitor 0.5 μL，M-MLV 1 μL（200 U）。反應(yīng)條件為：37 ℃ 2.5 h，72 ℃ 30 min。

PCR體系如下：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL，10×Buffer 2 μL，MgCl2 3 μL，10%甘油2 μL，上下游引物各2 μL（引物組合分別為A11/A22，B11/B22，C11/C22，D11/D22，E11/E22，F(xiàn)11/F22），dNTPs 0.4 μL（10 mmol·L-1），Taq DNA酶0.75 U，加去離子水至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán);72 ℃ 5 min。

1.4 PCR產(chǎn)物的克隆和測序

利用TaKaRa公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段，將回收的目的片段與pMD-18T載體連接。反應(yīng)體系如下：5 μL solution I buffer，1 μL pMD-18T載體，1 μL回收目的片段及3 μL去離子水，4 ℃過夜連接。

將10 μL連接產(chǎn)物加入30 μL JM109感受態(tài)細胞中，冰上放置30 min;42 ℃熱激45 s;冰浴1 min，加入LB液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。經(jīng)藍白斑篩選、PCR技術(shù)篩選陽性克隆，之后對陽性克隆進行雙向測序。

使用DNAMAN軟件對測序結(jié)果進行序列拼接;之后利用BLAST進行序列比較。利用CLUSTAL 1.83進行多序列比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR擴增及測序

利用CTAB法分離辣椒葉片總RNA，利用擴增辣椒輕斑駁病毒基因組不同區(qū)域的引物對，經(jīng)過不斷優(yōu)化RT-PCR反應(yīng)條件，最終擴增出了預(yù)期的辣椒輕斑駁病毒基因組不同區(qū)域片段（圖1）。利用膠回收試劑盒，將擴增產(chǎn)物進行切膠回收純化。之后進行克隆、測序，獲得了辣椒輕斑駁病毒中國分離物Hrb基因組不同區(qū)域片段的序列。

2.2 基因組特點分析

經(jīng)序列拼接，獲得了6 290 nt的辣椒輕斑駁病毒中國分離物Hrb基因組全序列（圖2）;該序列腺嘌呤∶胸腺嘧啶∶鳥嘌呤∶胞嘧啶的比例為19∶18∶15∶12。其核苷酸序列比GenBank中已報道的辣椒輕斑駁病毒基因組序列（GenBank登陸號：NC_003630）在700～768 nt處缺少69個核苷酸;序列缺失其并未造成移碼突變;在GenBank中未見類似缺失核苷酸的辣椒輕斑駁病毒分離物。

獲得的基因組序列包含4個開放閱讀框（ORF）：ORF1（70～4 842 nt）、ORF2（70～3 357 nt）、ORF3（4 843～5 616 nt）、ORF4（5 619～6 092 nt）分別編碼183 KDa蛋白、126 KDa蛋白、運動蛋白（28 KDa）、外殼蛋白（17 KDa）。3非編碼區(qū)、5非編碼區(qū)分別為198 nt、69 nt（圖2）。

辣椒輕斑駁病毒中國分離物Hrb基因組序列與GenBank中已報道的其他辣椒輕斑駁病毒基因組序列同源性為94.0%～99.6%，中國分離物Hrb的ORF1、ORF2、ORF3、ORF4所編碼蛋白分別與其他分離物氨基酸序列同源性為96.2%～97.7%、95.4%～96.8%、96.5%～99.6%、94.3%～98.1%（表2）。中國分離物Hrb非編碼區(qū)序列與其他分離物同源性分別為95.7%～98.6%、97.5%～100%。

將得到的辣椒輕斑駁病毒中國分離物Hrb基因組序列與煙草花葉病毒屬內(nèi)其他病毒進行了序列比較。此分離物與番茄花葉病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）親緣關(guān)系最近，核苷酸序列相似性為68.5%;與郁金香脈明病毒（Turnip vein clearing virus，TVCV）親緣關(guān)系最遠。ORF1、ORF2、ORF4的核苷酸序列相似性、氨基酸序列相似性均與番茄花葉病毒相似性最高，其次為煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）;與郁金香脈明病毒（Turnip vein clearing virus，TVCV）相似性最低。

基于辣椒輕斑駁病毒基因組運動蛋白及外殼蛋白序列，對不同辣椒輕斑駁病毒分離物進行了系統(tǒng)進化分析。獲得的分離物與日本分離物（PMMoV-J、C-1421、Pa18、TPO-2-19）親緣關(guān)系較近，并聚集在一起形成一個小的進化枝（圖3）;與西班牙分離物Ia親緣關(guān)系較遠。

3 討論與結(jié)論

我國自1994年首次報道了辣椒輕斑駁病毒后已有較多關(guān)于辣椒輕斑駁病毒危害辣椒的報道[1，3-4，9]。然而，當前尚未引起辣椒生產(chǎn)及科研人員的廣泛重視。辣椒種子可攜帶辣椒輕斑駁病毒，因而利于其快速傳播。此外，人類糞便中的辣椒輕斑駁病毒也具有侵染性，即使常規(guī)堆肥也難以徹底殺滅植物殘體、糞便中的辣椒輕斑駁病毒[5]。因而，當前我國辣椒輕斑駁病毒的危害范圍可能遠遠超過現(xiàn)有報道中的分布范圍。

目前已有的辣椒輕斑駁病毒的報道主要集中于華北、華東等地[1，4，9]，其他地域的相關(guān)報道較少，且該病毒中國分離物的分子變異特點也尚不明晰。東北林業(yè)大學生命科學學院植物病原微生物課題組前期研究中已獲得了一個辣椒輕斑駁病毒中國分離物，筆者獲得了其基因組序列并分析了其分子變異特點。當前我國已報道的辣椒輕斑駁病毒分離物較少，有必要通過大規(guī)模篩選分離，獲得更多辣椒輕斑駁病毒中國分離物，并進一步分析當前主要抗辣椒輕斑駁病毒基因?qū)Σ煌《痉蛛x物的有效性。

經(jīng)RT-PCR、克隆、測序，獲得了6 290 nt的辣椒輕斑駁病毒中國分離物Hrb基因組全序列;該序列與GenBank中已報道的其他辣椒輕斑駁病毒基因組的序列同源性為94.0%～99.6%。系統(tǒng)進化分析顯示辣椒輕斑駁病毒中國分離物Hrb與日本分離物親緣關(guān)系較近，與西班牙分離物Ia親緣關(guān)系較遠。

參考文獻

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