韓斯琴高娃， 張 晨， 陳薪璇， 張艷華， 哈斯烏力吉*

1. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)可調(diào)諧(氣體)激光技術(shù)國家級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 黑龍江 哈爾濱 150080 2. 內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科， 內(nèi)蒙古 通遼 028007 3. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科， 黑龍江 哈爾濱 150086

引 言

藥品濫用， 又被稱為“吸毒”， 是指非醫(yī)療目的連續(xù)大量使用具有使人產(chǎn)生依賴性的藥物。 當(dāng)前毒品被國際禁毒組織分為兩大類， 即精神藥品和麻醉藥品。 麻醉藥品和精神藥品的非法濫用已經(jīng)成為社會的一大危害， 嚴(yán)重危害了人們的生理和心理健康， 并且會誘發(fā)各種犯罪， 嚴(yán)重影響人們的生活秩序， 破壞社會風(fēng)氣。

經(jīng)常聽到的毒品名稱有海洛因、 甲基苯丙胺(俗稱“冰毒”)等， 但是對其他新型毒品可能還比較陌生， 如硝甲西泮、 艾司唑侖、 咪達(dá)唑侖、 麻古等。 二類精神藥品咪達(dá)唑侖(藥品名為力月西)的毒品案件屢有發(fā)生， 與海洛因的折算率為1 g咪達(dá)唑侖相當(dāng)于0.000 1 g海洛因。 咪達(dá)唑侖可產(chǎn)生抗焦慮、 鎮(zhèn)靜、 催眠、 抗驚厥及肌肉松弛的作用， 但也會使人產(chǎn)生譫妄、 幻覺等不良反應(yīng)。 在巨大的商業(yè)利潤驅(qū)動(dòng)下， 這種化合物被一些不法分子秘密的合成及非法交易。 目前對咪達(dá)唑侖的檢測方法主要有液相色譜法和氣相色譜法[1-2]等。 雖然這些方法都能檢測藥物濫用及過量問題， 但是上述方法一般需要較繁瑣的樣品處理步驟和較長的檢測時(shí)間， 并且需要大型的儀器設(shè)備， 因此研究一種現(xiàn)場、 快速、 低成本的檢測方法具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

雖然常規(guī)拉曼光譜技術(shù)的信號較弱， 但是隨著納米技術(shù)的發(fā)展， 以金或銀等貴金屬納米顆粒作為基底的表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)技術(shù)克服了傳統(tǒng)拉曼光譜信號弱的缺陷， 被廣泛應(yīng)用于食品藥品安全檢測及醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域[3-5]。 到目前為止， 雖然用其他方法檢測過咪達(dá)唑侖， 但是無人用SERS技術(shù)檢測過咪達(dá)唑侖， 本文基于SERS技術(shù)檢測了水溶液、 尿液和血清中的咪達(dá)唑侖， 為現(xiàn)場快速檢測打下了良好的基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

硝酸銀(AgNO3， 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)， 檸檬酸三鈉(C6H5NaO7·H20， 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)， 咪達(dá)唑侖注射液(C18H13ClFN3， 2 mL/10 mg/支， 江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司)， 人工尿液(創(chuàng)峰自動(dòng)化科技有限公司)。 掃描電子顯微鏡(SU8010， 日本日立公司)， 便攜式拉曼光譜儀(BES415-785H， 必達(dá)泰克光電科技公司)。

1.2 銀溶膠和樣品的制備

銀溶膠是SERS檢測中最常使用的活性增強(qiáng)基底， 經(jīng)典銀溶膠的制備方法最早是1982年， 由Lee和Meisel等提出[6]。 該方法使用檸檬酸鈉作為還原劑對硝酸銀進(jìn)行還原， 得到的銀溶膠。 首先在250 mL水中加入45 mg硝酸銀并加熱至沸騰， 然后加入5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸鈉溶液。 全程充分?jǐn)嚢瑁?維持沸騰狀態(tài)1 h。 當(dāng)溶液變?yōu)樽鼐G色時(shí)， 停止加熱， 自然冷卻至室溫， 并且避光儲存于4 ℃環(huán)境下， 備用。

咪達(dá)唑侖水溶液樣品的制備： 用去離子水稀釋咪達(dá)唑侖注射液注射液， 分別配置40， 20， 10， 8和6 μg·mL-1梯度質(zhì)量濃度的咪達(dá)唑侖水溶液。

咪達(dá)唑侖尿液樣品的制備： 按照文獻(xiàn)[7]的方法， 將咪達(dá)唑侖注射液滴入人工尿液中， 配置濃度分別為125， 100， 80， 60， 40和20 μg·mL-1梯度質(zhì)量濃度的尿液樣品。 取80 μL該樣品添加到1.5 mL的EP管中， 加入同體積濃度為1%的氫氧化鈉(NaOH)水溶液以調(diào)節(jié)pH 11； 然后加入氯化鈉(NaCl)固體， 使溶液充分飽和； 最后加入80 μL乙酸乙酯萃取， 靜置一分鐘取上層清液進(jìn)行檢測。

咪達(dá)唑侖血清樣品的制備： 使用前將儲存在-20 ℃的大鼠血清置于4 ℃冰箱解凍， 然后在室溫下使之全溶。 按文獻(xiàn)[8-10]的方法， 將血清樣品用去離子水稀釋至10%， 然后加入咪達(dá)唑侖標(biāo)準(zhǔn)液， 配置濃度為125， 100， 60， 40， 20和10 μg·mL-1的咪達(dá)唑侖溶液作為待測樣品。

2 結(jié)果與討論

2.1 銀溶膠的表征

使用掃描電子顯微鏡(SEM)， 對銀溶膠的形態(tài)進(jìn)行了表征， 如圖1(a)所示。 銀溶膠顆粒大小均勻， 形貌近似球形， 直徑約為50 nm。 利用紫外-可見分光光度計(jì)對銀溶膠的吸收特性進(jìn)行了表征， 如圖1(b)所示。 銀溶膠的最大紫外吸收峰位于409 nm處， 且兩側(cè)對稱， 半峰寬較窄， 說明銀溶膠顆粒尺寸分布均勻， 具有良好的單分散性[11]。

2.2 咪達(dá)唑侖拉曼特征峰的歸屬

首先使用Gaussian view軟件對咪達(dá)唑侖的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化[14]， 如圖2(a)所示。 然后通過Gaussian 09軟件計(jì)算了咪達(dá)唑侖的拉曼特征峰， 使用混合密度泛函B3LYP， 基組為6-31G(d, p)， 矯正因子為0.963。 獲得的理論特征峰與實(shí)驗(yàn)特征峰， 如圖2(b)所示。 咪達(dá)唑侖的理論與實(shí)驗(yàn)特征峰基本一致， 但是理論與實(shí)驗(yàn)之間有微小的偏移， 這是因?yàn)橥獠織l件不同導(dǎo)致的。 實(shí)驗(yàn)特征峰主要分布在689， 735， 827， 1 045和1 167 cm-1等處， 表1列出了特征峰的振動(dòng)模式。

圖1 (a)銀溶膠的SEM圖， (b)銀溶膠的紫外可見光吸收光譜圖

圖2 (a)優(yōu)化后的空間分子結(jié)構(gòu)示意圖， (b)咪達(dá)唑侖的理論光譜和SERS光譜

Fig.2 (a) Optimized spatial molecular structure of Midazolam, (b) Theoretical and SERS spectra of Midazolam

表1 咪達(dá)唑侖理論和實(shí)驗(yàn)振動(dòng)頻率

2.3 促凝劑的選取

在使用化學(xué)還原法合成銀溶膠的過程中， 檸檬酸鈉作為一種還原劑起到了至關(guān)重要的作用。 但是研究表明包裹在銀納米顆粒表面的檸檬酸根會阻止待測物對銀納米顆粒的吸附， 降低檢測信號， 因此需要添加適量的無機(jī)鹽來打破溶膠體系的電勢平衡從而使溶膠顆粒聚集[13]。 為了研究不同種類促凝劑對咪達(dá)唑侖SERS增強(qiáng)效果的影響， 實(shí)驗(yàn)中選取硫酸鈉(Na2SO4)、 硫酸鎂(MgSO4)、 氯化鈉(NaCl)、 碘化鉀(KI)水溶液作為促凝劑， 進(jìn)行了對比性的實(shí)驗(yàn)研究。 結(jié)果表明， 在相同濃度下， MgSO4水溶液的增強(qiáng)效率最高， 因此本實(shí)驗(yàn)中選取MgSO4水溶液作為促凝劑， 樣品、 銀溶膠和促凝劑的體積混合比均為5∶5∶1。

2.4 咪達(dá)唑侖水溶液的SERS檢測

梯度濃度咪達(dá)唑侖水溶液的SERS光譜， 如圖3(a)所示， 用空白水作為對照。 當(dāng)濃度低至6 μg·mL-1時(shí)， 仍然觀察到689 cm-1處的拉曼特征峰， 且滿足檢測下限大于等于3倍信噪比的要求， 因此對水溶液中咪達(dá)唑侖的檢測限可以達(dá)到6 μg·mL-1。 通過對數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合， 得到曲線方程y=188.18x-743.05， 相關(guān)系數(shù)r=0.972， 如圖3(b)所示。

為了驗(yàn)證該方法的可靠性， 配制了濃度分別為30， 15和7.5 μg·mL-1的咪達(dá)唑侖水溶液加標(biāo)樣品， 測定了咪達(dá)唑侖水溶液的濃度， 并以已知加標(biāo)濃度的比值計(jì)算出了回收率及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)， 如表2所示。 從表2可知， 該方法的回收率在98.2%～107.2%之間， RSD在2.08%～3.25%之間。

圖3 (a)梯度濃度咪達(dá)唑侖水溶液的SERS光譜， (b)特征峰強(qiáng)度隨咪達(dá)唑侖水溶液濃度的變化曲線

Fig.3 (a) SERS spectra of Midazolam in aqueous solution with different concentration, (b) the relationship between the Raman signal intensity and Midazolam concentration in aqueous solution

表2 咪達(dá)唑侖水溶液的回收率及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.5 尿液中咪達(dá)唑侖的檢測

梯度濃度咪達(dá)唑侖尿液的SERS光譜， 如圖4(a)所示， 用空白尿液作為對照。 當(dāng)濃度低至20 μg·mL-1時(shí)， 仍然觀察到689 cm-1處的拉曼特征峰， 且滿足檢測下限大于等于3倍信噪比的要求， 因此檢測限可以達(dá)到20 μg·mL-1。 通過對數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合， 得到線性方程y=59.78x-640.71， 相關(guān)系數(shù)r=0.958， 如圖4(b)所示。

圖4 (a)梯度濃度咪達(dá)唑侖尿液的SERS光譜， (b)特征峰強(qiáng)度隨咪達(dá)唑侖尿液濃度的變化曲線

Fig.4 (a) SERS spectra of Midazolam in urine with different concentration, (b) the relationship between the Raman signal intensity and Midazolam concentration in urine

為了驗(yàn)證該方法的可靠性， 配制了濃度分別為120， 70和30 μg·mL-1的咪達(dá)唑侖尿液加標(biāo)樣品， 測定了咪達(dá)唑侖尿液的濃度， 并與已知加標(biāo)濃度的比值計(jì)算出了回收率及其RSD， 如表3所列。 該方法的回收率在96.9%～107.9%之間， RSD在4.45%～5.75%之間。

2.6 血清中咪達(dá)唑侖的檢測

梯度濃度咪達(dá)唑侖血清的SERS光譜， 如圖5(a)所示， 用空白血清作為對照。 空白血清在689 cm-1附近也有個(gè)微小的拉曼峰， 為了排除血清對特征峰的干擾， 選取了827 cm-1處的特征峰進(jìn)行了血清中咪達(dá)唑侖的檢測。 當(dāng)濃度低至20 μg·mL-1時(shí)， 仍然觀察到827 cm-1處的拉曼特征峰， 且滿足檢測下限大于等于3倍信噪比的要求， 因此檢測限可以達(dá)到20 μg·mL-1。 通過對數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合， 得到曲線方程y=30.81x+176.66， 相關(guān)系數(shù)r=0.963， 如圖5(b)所示。

為了驗(yàn)證該方法的可靠性， 配制了濃度分別為125， 60和20 μg·mL-1咪達(dá)唑侖在血清中加標(biāo)樣品， 測定了咪達(dá)唑侖血清的濃度， 并與已知加標(biāo)濃度的比值計(jì)算出了回收率及其RSD， 如表4所列。 該方法的回收率在94.2%～105.7%之間， RSD在3.60%～4.41%之間。

表3 咪達(dá)唑侖尿液樣品的回收率及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

圖5 (a)梯度濃度咪達(dá)唑侖血清的SERS光譜， (b)特征峰強(qiáng)度隨咪達(dá)唑侖血清濃度的變化曲線

Fig.5 (a) SERS spectra of Midazolam in serum with different concentration, (b) the relationship between the Raman signal intensity and Midazolam concentration in serum

表4 咪達(dá)唑侖血清樣品的回收率及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 結(jié) 論

研究利用SERS技術(shù)快速檢測咪達(dá)唑侖。 首先從理論和實(shí)驗(yàn)兩個(gè)方面對咪達(dá)唑侖的拉曼特征峰進(jìn)行了歸屬。 然后以銀溶膠作為活性基底， MgSO4水溶液作為促凝劑， 分別選取689和827 cm-1處的拉曼峰作為特征峰， 對水溶液、 尿液和血清中的咪達(dá)唑侖進(jìn)行了SERS檢測。 獲得了檢測限、 拉曼特征峰強(qiáng)度隨濃度的變化曲線方程及相關(guān)系數(shù)、 回收率及其相對標(biāo)準(zhǔn)誤差。 該方法具有快速、 準(zhǔn)確、 無損、 操作簡便等優(yōu)點(diǎn)， 為水溶液、 尿液和血清中咪達(dá)唑侖的現(xiàn)場快速檢測奠定了良好的基礎(chǔ)。