李 蓉 ，路海蘇 ，胡書群 ，呂蘭欣 ，2

（1 徐州醫(yī)科大學(xué)，江蘇221002；2 徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院急救中心）

干細(xì)胞是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞[1]。干細(xì)胞在多種疾病中已獲得研究和應(yīng)用，如燒傷、骨創(chuàng)傷、骨腫瘤、血管再生及修復(fù)、神經(jīng)再生及修復(fù)、角膜修復(fù)、肝臟、肺、心肌修復(fù)等[2-3]。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有易分離、擴(kuò)增以及體外操作簡便等特點(diǎn)，在組織工程、細(xì)胞移植、基因治療等領(lǐng)域的應(yīng)用前景十分廣闊[4]。MSCs 遷移至受損部位進(jìn)行細(xì)胞替代，并分泌各種因子，幫助受損部位重建功能[5-6]。

多種趨化因子、生長因子及黏附分子對(duì)MSCs具有趨化作用，引導(dǎo)其向損傷區(qū)及其鄰近組織遷移，即干細(xì)胞歸巢[7]。干細(xì)胞的歸巢率在組織損傷治療中有著重要意義?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α（SDF-1α）及其趨化因子受體-4（CXCR4）在MSCs 遷移中發(fā)揮重要作用[8-10]。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs 表面存在趨化因子受體CXCR4 和 CX3CR1，損傷區(qū)域 SDF-1α 和 fractalkine等趨化因子表達(dá)增加，作用于移植細(xì)胞表面受體，引導(dǎo)其向缺血病灶遷移[11]。然而體外培養(yǎng)的MSCs 在傳代過程中，其表面CXCR4 受體逐漸減少，導(dǎo)致MSCs移植后歸巢效率低下，難以發(fā)揮應(yīng)有作用[12-13]。因此，提高M(jìn)SCs 體外培養(yǎng)過程中CXCR4 受體的表達(dá)效率在細(xì)胞治療中至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 材料 兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（賽業(yè)生物）；人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（順昊生物）；胎牛血清（FBS）（BI）；CCK-8 試劑盒（VICMED）；兔源 CXCR4 一抗（Abcam）；Alex594-抗兔二抗（Life Technology）；細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑（Hyclone）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Rabbit-MSCs）與人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（HUC-MSCs）用含有10%胎牛血清的 L-DMEM 重懸，于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。24 h 后換液，棄未貼壁細(xì)胞，待細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化后按1∶2 傳代，達(dá)到基本融合后再次消化傳代，進(jìn)行體外擴(kuò)增和富集。

1.2.2 MSCs 處理：（1）低氧培養(yǎng)：將生長旺盛的第3代細(xì)胞接種于10 cm 培養(yǎng)皿及24 孔板中，培養(yǎng)至70%～80%融合后，置于 37 ℃、3%O2、5%CO2、92%N2的飽和濕度孵育箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。以常氧培養(yǎng)作為對(duì)照，分別行免疫熒光染色及流式細(xì)胞儀檢測表面CXCR4 表達(dá)情況。（2）SDF-1 預(yù)處理：采用不同濃度SDF-1（1 ng/mL，10 ng/mL，100 ng/mL）培養(yǎng)液培養(yǎng)MSCs，以正常條件培養(yǎng)的MSCs 為對(duì)照組。在24h 檢測細(xì)胞活性，取高濃度組進(jìn)行免疫熒光染色及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面CXCR4 的表達(dá)。

1.2.3 CCK-8 檢測細(xì)胞活性：向96 孔板的待檢測細(xì)胞加入10%CCK-8 溶液培養(yǎng)2 h，每組6 個(gè)復(fù)孔，將100 μL 培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至新96 孔板，全波長酶標(biāo)儀檢測450 nm 處吸光值。

1.2.4 免疫熒光染色：將24 孔板各待測孔棄去培養(yǎng)液，PBS 洗滌；3% BSA（含 0.1%Triton-X100）封閉1 h；兔源 CXCR4 一抗（1∶200）4 ℃孵育過夜；PBS 洗滌 2 次，37 ℃孵育 Alex594-抗兔二抗 1 h；PBS 洗 2次后用DAPI 進(jìn)行細(xì)胞核染色，熒光顯微鏡觀察。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測：棄去細(xì)胞培養(yǎng)液后PBS 洗滌，0.25%胰酶消化，使細(xì)胞懸浮，移入離心管，1 000 r/min 離心 5 min；棄上清，用含 2%BSA 的 PBS 液制成濃度為106/mL 的單細(xì)胞懸液；加入PE-CXCR4 抗體，4℃孵育 40 min；PBS 洗滌 2 次，使用流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS12.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩組間比較時(shí)采用 Student’s T-test。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MSCs 鏡下觀察兔骨髓 MSCs 與人臍帶MSCs培養(yǎng)3 天后換液，棄未貼壁細(xì)胞，光鏡下觀察，可見細(xì)胞80%～90%融合，均勻貼壁，形態(tài)均一，呈生長旺盛的漩渦樣、輻射狀排列的單層細(xì)胞。人臍帶MSCs形態(tài)較兔骨髓MSCs 更為細(xì)長，體積更大，符合兩類細(xì)胞特征。見圖1。

圖1 MSCs 鏡下觀察

2.2 MSCs 培養(yǎng)活性測定CCK-8 檢測 結(jié)果顯示，不同濃度 SDF-1（1 ng/mL，10 ng/mL，100 ng/mL）預(yù)處理對(duì)Rabbit-MSCs 活性無影響（圖2A），低氧處理24 h 對(duì)細(xì)胞活力亦無顯著影響（圖2B）；HUC-MSCs和Rabbit-MSCs 分別經(jīng)高濃度SDF-1 及低氧預(yù)處理后的細(xì)胞活性與正常培養(yǎng)組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。說明上述預(yù)處理方法對(duì)MSCs 細(xì)胞活性無抑制作用。

圖2 兩種預(yù)處理培養(yǎng)后Rabbit-MSCs 細(xì)胞活性

圖3 兩種預(yù)處理培養(yǎng)后Rabbit-MSCs 和HUC-MSCs 細(xì)胞活性

2.3 流式細(xì)胞儀檢測MSCs 表面CXCR4 表達(dá) 正常培養(yǎng)條件下兔骨髓MSCs 及人臍帶MSCs 表面CXCR4 表達(dá)率很低，分別為0.81%和2.86%。經(jīng)高濃度SDF-1（100 ng/mL）和低氧處理后，兩種 MSCs 表面CXCR4 表達(dá)有所提高，其中低氧環(huán)境下CXCR4表達(dá)提高更明顯，兩種MSCs 表面CXCR4 表達(dá)率分別為正常培養(yǎng)的1.91 倍和2.3 倍。見圖4。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測MSCs 表面CXCR4 表達(dá)

2.4 CXCR4 免疫熒光染色 圖5 為Rabbit-MSCs和HUC-MSCs 免疫熒光染色結(jié)果，A/A’為正常培養(yǎng)組，可見其表面紅色熒光很少，說明CXCR4 表達(dá)率低；B/B’、C/C’為 SDF-1 高濃度處理組及低氧處理組，結(jié)果顯示，紅色熒光較正常培養(yǎng)組有明顯增多，說明兩種處理方法均可以提高M(jìn)SCs 表面CXCR4表達(dá)。這一結(jié)果與流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果一致。

圖5 CXCR4 免疫熒光染色

3 討 論

在眾多干細(xì)胞中，MSCs 由于取材方便、可自身來源、易于分離、體外擴(kuò)增能力強(qiáng)、無免疫排斥反應(yīng)、無倫理爭議等優(yōu)勢而成為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的優(yōu)選種子細(xì)胞[14-15]。骨髓來源和臍帶來源的MSCs 是兩類研究和應(yīng)用較為廣泛的間充質(zhì)干細(xì)胞，在腦外傷、腦卒中、神經(jīng)損傷、組織工程中被深入研究[15-18]。文獻(xiàn)報(bào)道，SDF-1 與 CXCR4 具有相互作用，MSCs 表達(dá) CXCR4，并沿SDF-1 濃度梯度進(jìn)行遷移[19]。然而，體內(nèi)MSCs 雖能表達(dá)較高水平的CXCR4，但隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長，MSCs 表達(dá)CXCR4 逐漸降低，從而影響MSCs 回輸至體內(nèi)向病灶區(qū)域遷移的能力[13，20-21]。因此，在干細(xì)胞治療研究中，提高體外培養(yǎng)過程中MSCs 表面CXCR4 的表達(dá)水平具有十分重要意義。

有研究表明，腫瘤壞死因子-α（TNF-α），白介素-6（IL-6）等可以誘導(dǎo) MSCs 表面 CXCR4 表達(dá)，但同時(shí)會(huì)抑制MSCs 增殖，甚至引起MSCs 凋亡[22]。研究顯示，CXCR4 基因修飾可促進(jìn)MSCs 向SDF-1 的定向遷移，在SDF-1 濃度適宜的條件下，定向遷移能力較對(duì)照組提高近5 倍，表明基因修飾是一種有效提高M(jìn)SCs 表面CXCR4 表達(dá)的方法[23]。但是目前基因修飾采用的慢病毒或腺病毒載體存在潛在風(fēng)險(xiǎn)，不宜大規(guī)模臨床試驗(yàn)的開展。

本研究旨在通過對(duì)MSCs 進(jìn)行低氧和SDF-1 處理，提高M(jìn)SCs 表面CXCR4 的表達(dá)。結(jié)果顯示，低氧和SDF-1 兩種處理方法均未抑制MSCs 的活性，適用于體外MSCs 的培養(yǎng)和擴(kuò)增。流式細(xì)胞儀和免疫熒光檢測顯示，低氧和SDF-1 處理后MSCs 表面CXCR4 表達(dá)水平均有提高，其中低氧處理對(duì)提高兩種MSCs 表面CXCR4 表達(dá)的效果均明顯優(yōu)于SDF-1 處理。Liu 等[13]研究結(jié)果顯示，人骨髓來源 MSCs 在3%O2環(huán)境培養(yǎng)2 h 后其表面CXCR4 的表達(dá)是正常培養(yǎng)的4 倍左右。上述結(jié)果均表明，低氧環(huán)境培養(yǎng)MSCs 可有效提高M(jìn)SCs 靶向性遷移能力，有助于解決干細(xì)胞治療中存在的細(xì)胞移植方式、細(xì)胞歸巢、細(xì)胞定植數(shù)量少等瓶頸問題，同時(shí)，低氧處理不需要使用昂貴的生長因子，是一種安全、廉價(jià)的方法。但需要指出的是，與以往研究結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，低氧處理MSCs 表面表達(dá)CXCR4 的效率與基因修飾法的差距較大，因此需要進(jìn)一步研究如何更有效提高低氧處理的效率。有研究表明，低氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）可以提高 MSCs 表面 CXCR4 的表達(dá)[13]。HIF-1 是一種異源二聚體，主要由HIF-1α 和HIF-1β 兩個(gè)亞單位組成。HIF-1β 在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，發(fā)揮結(jié)構(gòu)性作用[24]。HIF-1α 是 HIF-1 的活性亞基，受缺氧信號(hào)的調(diào)控。推測在低氧條件下，細(xì)胞內(nèi)的缺氧環(huán)境活化HIF-1α 亞基，從而使得細(xì)胞表面CXCR4 表達(dá)增高。因此，進(jìn)一步研究HIF-1α 通過哪些信號(hào)通路影響CXCR4 的表達(dá)，可能有助于提高低氧處理促進(jìn)CXCR4 表達(dá)的效率。

綜上所述，本研究通過低氧預(yù)處理及SDF-1 預(yù)處理對(duì)兩種來源的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，采用CCK-8 檢測細(xì)胞活性，免疫熒光染色及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面CXCR4 表達(dá)情況，結(jié)果表明兩種處理方法均不影響細(xì)胞活性，能提高細(xì)胞表面CXCR4 表達(dá)，其中低氧預(yù)處理的效果更為顯著。提示低氧環(huán)境下進(jìn)行MSCs 體外培養(yǎng)是提高CXCR4 表達(dá)的有效、廉價(jià)方法，有望在臨床干細(xì)胞治療中廣泛應(yīng)用。