周 呂, 孟建玉, 楊昌利, 李 錦, 胡朝興, 張長(zhǎng)禹,*

(1. 貴州大學(xué)昆蟲研究所, 貴州省山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴陽(yáng) 550025; 2. 貴州省煙草科學(xué)研究院, 貴陽(yáng) 550081)

熱激蛋白(heat shock proteins, Hsps)又被稱為熱休克蛋白，是一類廣泛存在于各種生物體內(nèi)并在進(jìn)化上高度保守的特殊蛋白質(zhì)(Zhao and Jones, 2012; 司風(fēng)玲等, 2016)。自然界中，熱激蛋白可在多種生物脅迫(如真菌、細(xì)菌、病毒、昆蟲等)和非生物脅迫(如UV、重金屬、高溫、低溫、水分、藥劑、鹽濃度等)下誘導(dǎo)表達(dá)(馬文靜和馬紀(jì), 2012)。熱激蛋白主要功能是作為分子伴侶參與到蛋白質(zhì)的合成、折疊、組裝過(guò)程中，影響細(xì)胞的分泌和調(diào)節(jié)活動(dòng)，是生物適應(yīng)環(huán)境脅迫的重要適應(yīng)機(jī)制之一(Parsell and Lindquist, 1993)。根據(jù)熱激蛋白的分子量，可將熱激蛋白分為Hsp90, Hsp70, Hsp60, Hsp40和小分子熱激蛋白(Feder and Hofmann, 1999; S?rensenetal., 2003; Gkouvitsasetal., 2009)。Hsp90是一類正常細(xì)胞中不可缺少的蛋白質(zhì)，廣泛存在于原核生物和真核生物中，在昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育和對(duì)極端環(huán)境的適應(yīng)中發(fā)揮著重要作用(Rutherfordetal., 2007; 賈棟, 2015; 姜建軍等, 2019)。如煙蚜MyzuspersicaeHsp90基因在UV-B脅迫下的表達(dá)量顯著上升，并隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)(蘇麗等, 2018)。高溫對(duì)甜菜夜蛾Spodopteraexigua幼蟲體內(nèi)Hsp90基因表達(dá)有明顯誘導(dǎo)作用，表達(dá)量隨溫度增加呈上升趨勢(shì)(翟會(huì)芳等, 2010)。

近年來(lái)，由于環(huán)境變化，大氣中的臭氧含量減少，導(dǎo)致地球表面的紫外線輻射越來(lái)越強(qiáng)(Xu and Sullivan, 2010)。根據(jù)波長(zhǎng)，可將紫外線分為UV-A, UV-B和UV-C。其中UV-A輻射可以影響生物的生長(zhǎng)發(fā)育和行為選擇(Verdagueretal., 2016; Zhouetal., 2018)。Zhang等(2011)研究發(fā)現(xiàn)，UV-A照射會(huì)使棉鈴蟲Helicoverpaarmigera成蟲的壽命縮短而生殖力提升。UV-A照射還能誘導(dǎo)棉鈴蟲雌蟲體內(nèi)JNK基因的表達(dá)(劉小飛等, 2019)。溫度也是影響昆蟲生理生化的重要因素。在高溫處理下，昆蟲會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)速率下降、滯育、畸形和無(wú)法交配產(chǎn)卵等現(xiàn)象(Butleretal., 1985; 馬春森和陳瑞鹿, 1993; Williamsetal., 2003; 羅舉等, 2005)。低溫會(huì)影響昆蟲的存活率、壽命和相關(guān)基因的表達(dá)(馬春森等, 2005; 孔雪華等, 2012; 李耀華等, 2017)。沙蔥螢葉甲Galerucadaurica2齡幼蟲經(jīng)過(guò)-10, -5和0℃的低溫脅迫1 h，25℃恢復(fù)30 min后，其表皮蛋白基因GdAbd表達(dá)顯著上調(diào)(單艷敏等, 2019)。

草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda屬鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)灰翅夜蛾屬Spodoptera，又名秋黏蟲，是一種廣泛分布于美洲大陸熱帶和亞熱帶地區(qū)的雜食性昆蟲(Todd and Poole, 1980)。幼蟲可取食玉米、水稻、高粱、棉花和蔬菜等多種農(nóng)作物(Montezanoetal., 2018)。草地貪夜蛾成蟲具有極強(qiáng)的遷飛能力，自2019年1月在我國(guó)云南被發(fā)現(xiàn)，至6月已經(jīng)擴(kuò)散至我國(guó)南方18個(gè)省(Goergenetal., 2016; Feldmannetal., 2019; 唐璞等, 2019)。目前，國(guó)內(nèi)有關(guān)草地貪夜蛾響應(yīng)環(huán)境脅迫的分子機(jī)制研究較少。本研究通過(guò)克隆草地貪夜蛾體內(nèi)Hsp90基因，分析其序列特征和表達(dá)譜，檢測(cè)其在不同齡期和成蟲不同組織中的表達(dá)，研究其在UV-A、高溫和低溫脅迫下的差異表達(dá)，揭示Hsp90基因在響應(yīng)環(huán)境脅迫中的作用，探索草地貪夜蛾響應(yīng)環(huán)境脅迫的分子機(jī)制，為探究草地貪夜蛾適應(yīng)環(huán)境脅迫的機(jī)理，制定科學(xué)的防治策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 試蟲

本實(shí)驗(yàn)所用草地貪夜蛾于2019年7月在貴州省安順市普定縣野外玉米田中采集獲得。成蟲由野外采集的幼蟲羽化而成，幼蟲為實(shí)驗(yàn)室玉米葉飼養(yǎng)后代。飼養(yǎng)條件：溫度25±1℃，相對(duì)濕度70%±5%，光周期16L∶8D。

1.2 樣本處理

選取草地貪夜蛾卵、1-6齡幼蟲、蛹、成蟲作為不同發(fā)育階段樣本。選取羽化后3 d雌雄成蟲的頭(去除觸角和復(fù)眼)、胸、腹、觸角、復(fù)眼、足、中腸、翅、精巢(雄蟲)和卵巢(雌蟲)等作為組織樣本。取羽化后3 d的雌雄成蟲，設(shè)置4℃和36℃的溫度處理，處理時(shí)間為0(CK), 30, 60, 90, 120和150 min，作為不同溫度處理樣本。選取羽化后3 d的雌雄成蟲，暗適應(yīng)2 h后，以UV-A(波長(zhǎng)315～400 nm)紫外燈為光源，對(duì)草地貪夜蛾雌雄成蟲進(jìn)行照射處理，照射強(qiáng)度為300 μW/cm2，處理時(shí)間為0(CK), 30, 60, 90, 120和150 min，照射期間溫濕度和正常飼養(yǎng)條件一致，作為UV-A處理樣本。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，各發(fā)育階段每重復(fù)樣本數(shù)分別為：卵50粒，1齡幼蟲20頭，2-3齡幼蟲10頭，4-6齡幼蟲、蛹和成蟲均為8頭；組織樣本每個(gè)重復(fù)解剖8頭成蟲。

1.3 總RNA提取和cDNA合成

使用Eastep? Super Total RNA Extraction Kit試劑盒提取草地貪夜蛾總RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量，使用NanoPhotometerTMP-Class分光光度儀檢測(cè)其濃度，按照HiFiScript cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書完成cDNA第1鏈的合成。

1.4 草地貪夜蛾Hsp90基因的克隆

通過(guò)對(duì)已知同源昆蟲斜紋夜蛾Spodopteralitura的Hsp90基因(GenBank登錄號(hào): AF254880.1)序列進(jìn)行比對(duì)，在保守區(qū)設(shè)計(jì)1對(duì)簡(jiǎn)并引物Hsp90-F/Hsp90-R(表1)，以1.3節(jié)合成的cDNA第1鏈為模板擴(kuò)增草地貪夜蛾Hsp90基因的中間片段。PCR反應(yīng)體系(25 μL): TaKaRa Ex Primer TaqTM酶(1.25 μmol/25 μL)12.5 μL, cDNA模板1.5 μL, 正反向引物(10 mmol/L)各1.5 μL, DEPC水8 μL。反應(yīng)條件: 95℃ 3 min, 95℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 1 min, 35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，使用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收目的片段，連接到pMDTM19-T載體并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單一菌落經(jīng)PCR檢測(cè)正確后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，菌液送往上海生工生物有限公司測(cè)序。

在獲得的目的基因片段的基礎(chǔ)上繼續(xù)向兩端設(shè)計(jì)引物Hsp90-F2/Hsp90-R2和Hsp90-F3/Hsp90-R3(表1)，以cDNA第1鏈為模板，經(jīng)PCR反應(yīng)后，擴(kuò)增出草地貪夜蛾編碼區(qū)序列。對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，送往上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.5 草地貪夜蛾Hsp90基因的序列分析

利用DNAMAN6.0對(duì)所得基因片段進(jìn)行拼接，使用NCBI(https:∥blast. Ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中的Blast工具進(jìn)行氨基酸的同源性分析;利用ORFfinder (http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)分析草地貪夜蛾Hsp90基因的開(kāi)放閱讀框；使用ExPASy ProtParam Tool (https:∥web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)、KinasePhos和ExPASy Tools中的NetNGlyc預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；以脊索動(dòng)物門青魚Mylopharyngodonpiceus的Hsp90(GenBank登錄號(hào):AVO65120.1)為外群，利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因比對(duì)，使用MEGA6.0采用鄰接(neighbor-joining)法1 000次構(gòu)建草地貪夜蛾和其他昆蟲Hsp90的系統(tǒng)發(fā)育樹；應(yīng)用ExPASy ScanProsite (https:∥prosite.expasy.org/ scanprosite/)進(jìn)行家族簽名序列分析。

1.6 草地貪夜蛾Hsp90基因的表達(dá)分析

取1.2節(jié)草地貪夜蛾不同處理材料，采用Eastep? Super Total RNA Extraction Kit試劑盒分別提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(HiFiScript cDNA Synthesis Kit)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用RT-qPCR分析草地貪夜蛾Hsp90基因在草地貪夜蛾不同發(fā)育階段和成蟲組織中的表達(dá)量差異,以及其在不同時(shí)長(zhǎng)UV-A脅迫和不同溫度脅迫下草地貪夜蛾成蟲中表達(dá)量的變化。根據(jù)草地貪夜蛾Hsp90基因的全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)1對(duì)定量引物qHsp90-F/qHsp90-R；選用核糖體蛋白L27(ribosomal protein L27, RPL27)基因作為內(nèi)參基因，Sf-RPL27-qPCR-F/Sf-RPL27-qPCR-R作為內(nèi)參基因引物(Karamipouretal., 2018)(表1)，采用SYBR Green Supemix 染料(TaKaRa公司)法進(jìn)行RT-qPCR，反應(yīng)體系(20 μL): cDNA模板2 μL, 2×iTaqTMSYBR Green Supermix 10 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件: 95℃ 3 min; 95℃ 30 s, 58℃ 30 s, 進(jìn)行39個(gè)循環(huán); 65℃ 5 s。

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用2-△△CT法(Livak and Schmittgen, 2001)對(duì)草地貪夜蛾Hsp90基因的表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPASS21.0軟件中的Duncan氏多重比較對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 草地貪夜蛾Hsp90基因克隆與序列分析

以草地貪夜蛾的cDNA為模板，經(jīng)克隆得到2 323 bp基因序列，命名為SfHsp90(GenBank登錄號(hào): MN832694)，經(jīng)NCBI分析可知開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)2 154 bp，編碼717個(gè)氨基酸(圖1)。草地貪夜蛾Hsp90 C末端序列為EEVD(圖2)，表明該蛋白具有細(xì)胞質(zhì)型熱激蛋白氨基酸特征，屬于胞質(zhì)熱激蛋白；編碼蛋白相對(duì)分子量為82.52 kD；等電點(diǎn)(pI)為5.01；帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)(Asp+Glu)為144個(gè)，帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg+Lys)為107個(gè)；分子式為C3634H5798N968O1161S28；N末端是M(Met)，推測(cè)半衰期為30 h，穩(wěn)定性系數(shù)為39.23，說(shuō)明該蛋白質(zhì)性質(zhì)穩(wěn)定。總平均疏水指數(shù)為-0.679，提示其為親水性蛋白質(zhì)。

圖1 草地貪夜蛾熱激蛋白基因SfHsp90的核苷酸序列以及推斷的氨基酸序列Fig. 1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of heat shock protein gene SfHsp90 from Spodoptera frugiperda單下劃線代表起始密碼子ATG, 星號(hào)代表終止密碼子TAA, 框內(nèi)為Hsp90的家族簽名序列，雙下劃線是糖基化位點(diǎn)，陰影部分標(biāo)注的是磷酸化位點(diǎn)，單波浪下劃線是C端共識(shí)序列EEVD。The single underline represents the initiation codon ATG, the asterisk represents the termination codon TAA, the family signature sequence of Hsp90 is in the box, the double underline is the glycosylation site, the shaded part is the phosphorylation site, and the single wavy underline is the C-terminal consensus sequence EEVD.

圖2 草地貪夜蛾與其他物種Hsp90的多序列比對(duì)Fig. 2 Multiple sequence alignment of Hsp90 from Spodoptera frugiperda and other speciesHsp90來(lái)源物種GenBank登錄號(hào)Origin species of Hsp90 and their GenBank accession numbers: SfHsp90: 草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda (MN832694); SlHsp90: 斜紋夜蛾Spodoptera litura (XP_022834656.1); LsHsp90: 草地螟Loxostege sticticalis (ABW87791.1); HaHsp90: 異色瓢蟲Harmonia axyridis (AWV96614.1)； MpHsp90: 青魚Mylopharyngodon piceus (AVO65120.1).

2.2 草地貪夜蛾Hsp90系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖3 鄰接法構(gòu)建的基于Hsp90氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of Hsp90 constructed by neighbor-joining method based on amino acid sequence利用Bootstrap進(jìn)行1 000次計(jì)算以檢驗(yàn)進(jìn)化樹分支置信度，分支上數(shù)值表示置信度。Bootstrap was used for 1 000 calculations to test the confidence of the branch of the evolutionary tree. The value on the branch indicates the confidence.

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索鱗翅目、鞘翅目、雙翅目和半翅目22種昆蟲和外群生物青魚Mylopharyngodonpiceus的Hsp90氨基酸序列，與推導(dǎo)的草地貪夜蛾SfHsp90氨基酸序列采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結(jié)果表明，系統(tǒng)發(fā)育樹分成2個(gè)大的分支，其中昆蟲綱23種昆蟲聚為一支，外群生物青魚單獨(dú)聚為一支，表明Hsp90的高度保守性；昆蟲綱中，鱗翅目、鞘翅目、雙翅目和半翅目昆蟲分別聚為一支，與傳統(tǒng)昆蟲分類學(xué)結(jié)果一致。從目以下的分類階元來(lái)看，草地貪夜蛾與斜紋夜蛾Spodopteralitura、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera、苜蓿夜蛾Heliothisviriplaca、大螟Sesamiainferens、二化螟Chilosuppressalis、草地螟Loxostegesticticalis、夏威夷紅蛺蝶Vanessatameamea、落葉松毛蟲Dendrolimussuperans聚為一支，說(shuō)明其親緣關(guān)系較近，其中草地貪夜蛾與斜紋夜蛾親緣關(guān)系最近，同其他幾個(gè)目昆蟲的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，和魚綱中的青魚親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.3 草地貪夜蛾SfHsp90基因的表達(dá)分析

SfHsp90基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)量存在顯著的差異(P<0.05)， 在1齡幼蟲中的表達(dá)量最高，其次是在卵中的表達(dá)量，在2齡和3齡幼蟲期也有較高的表達(dá)量；4-6齡幼蟲中的表達(dá)量較低，6齡幼蟲表達(dá)量最低(圖4)。SfHsp90在成蟲不同組織中的表達(dá)量也存在顯著差異(P<0.05)，在雄成蟲頭部(去除觸角和復(fù)眼)、觸角、復(fù)眼、中腸和精巢中表達(dá)量較高，在其余部位表達(dá)量較低；在雌成蟲頭部(去除觸角和復(fù)眼)、觸角、復(fù)眼和卵巢中有較高的表達(dá)，在其他部位的表達(dá)量較低(圖5)。

圖4 草地貪夜蛾SfHsp90在不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)水平Fig. 4 Relative expression levels of SfHsp90 in different developmental stages of Spodoptera frugiperdaE: 卵Egg; L1-L6: 分別為1-6齡幼蟲1st-6th instar larva, respectively; P: 蛹Pupa; M: 雄成蟲Male adult. 數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，柱上不同小寫字母表示不同發(fā)育階段間的相對(duì)表達(dá)量存在顯著性差異(P<0.05, Duncan氏多重比較)。Data are mean±SD. Different lowercase letters above bars indicate significant difference in the expression level between different developmental stages (P<0.05, Duncan’s multiple range test).

圖5 草地貪夜蛾雌雄成蟲不同組織中SfHsp90的相對(duì)表達(dá)水平Fig. 5 Relative expression levels of SfHsp90 in different tissues of male and female adults of Spodoptera frugiperdaHD: 去除觸角和復(fù)眼的頭部Head with antennae and compound eyes removed; TX: 胸部Thorax; AN: 腹部Abdomen; AA: 觸角Antenna; CE: 復(fù)眼Compound eye; FT: 足Leg; WG: 翅Wing; MT: 中腸Midgut; TS: 精巢Testis; OY: 卵巢Ovary. 數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，柱上不同小寫字母表示不同組織間的相對(duì)表達(dá)量存在顯著性差異(P<0.05, Duncan氏多重比較)。Data are mean±SD. Different lowercase letters above bars indicate significant difference in the relative expression level between different tissues (P<0.05, Duncan’s multiple range test).

如圖6所示，36℃處理下，除雌蟲30 min處理外，雌雄成蟲SfHsp90表達(dá)量均顯著高于對(duì)照(0 min) (P<0.05);雄成蟲的SfHsp90表達(dá)量隨著處理時(shí)間的增加呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，在處理時(shí)間為60 min時(shí)達(dá)到最高值，在90, 120和150 min時(shí)表達(dá)量逐漸下降；雌成蟲的SfHsp90表達(dá)量隨著處理時(shí)間的增加而升高，在處理時(shí)間為150 min時(shí)達(dá)到最高值。

圖6 不同時(shí)長(zhǎng)36℃高溫處理下草地貪夜蛾雌雄成蟲SfHsp90的相對(duì)表達(dá)量Fig. 6 Relative expression levels of SfHsp90 in male and female adults of Spodoptera frugiperdaexposed to high temperature of 36℃ for different time數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，柱上不同小寫字母表示不同處理時(shí)間的相對(duì)表達(dá)量存在顯著性差異(P<0.05, Duncan氏多重比較)。 Data are mean±SD. Different lowercase letters above bars indicate significant difference in the relative expression level between different exposure time (P<0.05, Duncan’s multiple range test). 圖7和8同The same for Figs. 7 and 8.

如圖7所示，在4℃的低溫處理下，SfHsp90的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照(0 min)(P<0.05)，其中，雄成蟲中的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在30 min處理時(shí)達(dá)到最高值，隨后表達(dá)量逐漸下降；雌成蟲中的表達(dá)量隨著處理時(shí)間的增加呈逐漸升高的趨勢(shì)，在處理時(shí)間到達(dá)150 min時(shí)達(dá)到最高值。

圖7 不同時(shí)長(zhǎng)4℃低溫處理下草地貪夜蛾雌雄成蟲SfHsp90的相對(duì)表達(dá)量Fig. 7 Relative expression levels of SfHsp90 in male and female adults of Spodoptera frugiperda exposedto low temperature of 4℃ for different time

如圖8所示，不同時(shí)長(zhǎng)UV-A處理下，SfHsp90表達(dá)量與對(duì)照均有顯著差異(P<0.05)，且隨著處理時(shí)間的增加，雄成蟲體內(nèi)SfHsp90的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，在處理時(shí)間為90 min的時(shí)候達(dá)到最高值；雌成蟲體內(nèi)的表達(dá)量也會(huì)隨著處理時(shí)間的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在處理時(shí)間為60 min時(shí)為最高值。

圖8 不同時(shí)長(zhǎng)UV-A處理下草地貪夜蛾雌雄成蟲SfHsp90的相對(duì)表達(dá)量Fig. 8 Relative expression levels of SfHsp90 in male and female adults of Spodoptera frugiperda exposedto UV-A for different time

3 討論

本研究通過(guò)斜紋夜蛾Hsp90設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，通過(guò)RT-PCR技術(shù)成功克隆了草地貪夜蛾Hsp90基因SfHsp90，該基因開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)2 154 bp，編碼717個(gè)氨基酸。經(jīng)氨基酸序列分析可知，該基因具有1個(gè)家族簽名序列，4個(gè)糖基化位點(diǎn)和11個(gè)磷酸化位點(diǎn)。使用DNAMAN6.0進(jìn)行氨基酸同源性分析可知，SfHsp90與其他物種的Hsp90具有較高的同源性，其中同源性最高的是斜紋夜蛾Hsp90；系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，親緣關(guān)系相近的同一個(gè)目的昆蟲聚為一支，表明Hsp90在進(jìn)化中相對(duì)保守，這與綠盲蝽Apolyguslucorμm和煙蚜等昆蟲的研究結(jié)果(Sunetal., 2014; 蘇麗等, 2018)一致。

熱激蛋白Hsp90是一種廣泛存在于真核生物細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，當(dāng)生物受到外界環(huán)境的脅迫時(shí)，其表達(dá)量會(huì)出現(xiàn)顯著變化(Buchner, 1996; Whitesell and Lindquist, 2005)。通過(guò)與多種酶和蛋白之間的相互作用，可有效穩(wěn)定蛋白的失活，在昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育、熱脅迫和適應(yīng)極端溫度時(shí)發(fā)揮著重要作用(Jakob, 1995a, 1995b; Buchner, 1996; Fengetal., 2010)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SfHsp90在不同發(fā)育階段中的表達(dá)量差異顯著，1齡幼蟲時(shí)表達(dá)量最高，幼蟲期時(shí)隨著發(fā)育時(shí)間增加表達(dá)量逐漸減少，蛹期和成蟲期表達(dá)量逐漸上升(圖4)。這與張敏等(2009)對(duì)中紅側(cè)溝繭蜂Microplitismediator的研究結(jié)果一致。然而，Sonoda等(2006)研究發(fā)現(xiàn)，小菜蛾P(guān)lutellaxylostellaHsp90在整個(gè)發(fā)育階段表達(dá)量都沒(méi)有顯著的變化；斜紋夜蛾Hsp90在成蟲中的表達(dá)量最高(Shuetal., 2011)。由此可見(jiàn)，不同物種在發(fā)育階段的表達(dá)具有不同的規(guī)律，說(shuō)明Hsp90在不同物種間的表達(dá)有著特異性。不同組織間的基因表達(dá)水平亦有差異，本研究發(fā)現(xiàn)，SfHsp90在不同組織中均有表達(dá)，且不同組織間表達(dá)量差異顯著(圖5)，這與林亞秋等(2009)對(duì)草魚Ctenopharyngodonidellus的研究結(jié)果相一致。SfHsp90在頭(去除觸角和復(fù)眼)、觸角、復(fù)眼中的表達(dá)量顯著高于其他組織(圖5)，這可能是由于頭部是昆蟲感覺(jué)的中心，觸角和復(fù)眼是昆蟲接受外界信息的重要器官，是時(shí)刻感應(yīng)著外界環(huán)境變化的敏感部位，所以導(dǎo)致了Hsp90的高表達(dá)(魏國(guó)樹等, 2002; 那杰等, 2008)。

本研究發(fā)現(xiàn)，草地貪夜蛾雌雄成蟲在36℃高溫和4℃低溫處理后，體內(nèi)的SfHsp90表達(dá)量顯著提高(圖6和7)。這說(shuō)明Hsp90可響應(yīng)環(huán)境溫度脅迫，幫助昆蟲適應(yīng)外界條件的變化(楊靜等, 2017)。在兩種溫度脅迫下，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，草地貪夜蛾雄成蟲的SfHsp90表達(dá)量都呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，36℃處理在60 min時(shí)達(dá)到最高值，4℃處理在30 min時(shí)達(dá)到最高值，隨后表達(dá)量都逐漸下降(圖6和7)。這可能是因?yàn)镠sp90的保護(hù)作用有其閾值存在，在環(huán)境脅迫超過(guò)一定限度時(shí)，Hsp90的表達(dá)量會(huì)下降。這與Cheng等(2016)發(fā)現(xiàn)麥紅吸漿蟲Sitodiplosismosellana幼蟲Hsp90在高低溫脅迫時(shí)其表達(dá)量都呈現(xiàn)先上升后下降的結(jié)果相符。楊靜等(2017)對(duì)粘蟲的研究也表明，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，高溫和低溫處理下的Hsp90表達(dá)量也會(huì)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。草地貪夜蛾雌成蟲SfHsp90表達(dá)量變化趨勢(shì)與雄成蟲不同；兩個(gè)溫度處理下，雌成蟲SfHsp90的表達(dá)量都顯著高于對(duì)照(30 min除外)，且隨著處理時(shí)間的增加，表達(dá)量逐漸增加，在150 min時(shí)達(dá)到最高值(圖6和7)。這表明草地貪夜蛾雌成蟲在遭遇到溫度脅迫時(shí)，其體內(nèi)SfHsp90修復(fù)細(xì)胞的時(shí)間閾值在150 min或更長(zhǎng)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于雄成蟲，說(shuō)明雌成蟲對(duì)環(huán)境中的溫度脅迫具有更強(qiáng)的適應(yīng)能力。郅倫山(2005)研究中華通草蛉Chrysopasinica發(fā)現(xiàn)雌蟲的越冬存活率顯著高于雄蟲，與本研究結(jié)果相符。Renault等(2002)的研究也指出，性別會(huì)影響昆蟲的越冬存活率。

作為太陽(yáng)紫外線輻射的主要成分之一，UV-A輻射影響昆蟲體內(nèi)多種基因的表達(dá)(Alietal., 2017; 劉小飛等, 2019)。本研究發(fā)現(xiàn)，不同時(shí)間(雄成蟲處理150 min除外)UV-A處理下SfHsp90的表達(dá)量都顯著提高(圖8)，表明UV-A照射能誘導(dǎo)Hsp90的表達(dá)。這與昆蟲面對(duì)溫度和藥劑脅迫時(shí)的研究結(jié)果 (蔣健等, 2013; 姜建軍等, 2019)相符。草地貪夜蛾雌雄成蟲SfHsp90表達(dá)量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在雄成蟲中照射90 min時(shí)表達(dá)量最高，在雌成蟲中照射60 min達(dá)到最高值(圖8)。這可能是因?yàn)閁V-A的脅迫造成了草地貪夜蛾細(xì)胞損傷，導(dǎo)致了SfHsp90的表達(dá)量上調(diào)，以修復(fù)細(xì)胞損傷、抵御UV-A輻射(Jurkiewicz and Buettner, 1994)。隨后，長(zhǎng)時(shí)間的照射導(dǎo)致SfHsp90表達(dá)量出現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖8)，可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的UV-A脅迫對(duì)昆蟲造成的損傷超過(guò)Hsp90保護(hù)作用的限度，這與Didomenico等(1982)研究Hsp70得出的結(jié)果相似。此外，草地貪夜蛾在不同時(shí)長(zhǎng)的UV-A照射下，雌成蟲SfHsp90的表達(dá)量均高于雄成蟲的(圖8)，推測(cè)草地貪夜蛾雌成蟲對(duì)UV-A輻射的抵抗能力可能高于雄成蟲。

近年來(lái)，大氣臭氧層被破壞，隨之而來(lái)的太陽(yáng)輻射紫外線增強(qiáng)，全球氣候逐漸變暖等問(wèn)題不可避免地加重了自然界中生物的生存壓力。草地貪夜蛾作為一種入侵害蟲，其如何抵抗環(huán)境脅迫的相關(guān)機(jī)理研究仍有欠缺。本研究初步闡明了SfHsp90在響應(yīng)高低溫和UV-A輻射脅迫的表達(dá)變化，為進(jìn)一步探索昆蟲響應(yīng)環(huán)境脅迫時(shí)的分子機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。