郭志敏, 鄧曉倩, 李 靜, 袁茂鈞, 萬 虎, 李建洪, 馬康生

(華中農(nóng)業(yè)大學植物科學技術學院, 昆蟲資源利用與害蟲可持續(xù)治理湖北省重點實驗室, 武漢 430070)

草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda屬鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)，是一種非常重要的農(nóng)業(yè)害蟲。該蟲具有遷飛能力強、繁殖力高、暴發(fā)危害等特點，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織向全球預警的跨國界遷飛的重大害蟲。草地貪夜蛾可為害玉米、水稻、小麥等353種植物(Montezanoetal., 2018)。草地貪夜蛾自2019年1月8號侵入我國云南省普洱市江城區(qū)后，呈快速擴散蔓延趨勢。2019年間，全國共有26個省(市、區(qū))1 538個縣(區(qū)、市)發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾(金濤等, 2020)，累計發(fā)生面積約113萬ha，主要危害玉米(98.1%)，危害之重、蔓延之廣令人震驚。

化學農(nóng)藥在病蟲害的防治中起著主要作用。在草地貪夜蛾的防控上，化學農(nóng)藥以其高效、快速的特點成為防治殺手锏。在草地貪夜蛾的起源地美洲，主要依賴傳統(tǒng)有機磷、氨基甲酸酯和擬除蟲菊酯類殺蟲劑對草地貪夜蛾進行控制，但是很快草地貪夜蛾對這些殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性。1989-1990年，田間抗藥性監(jiān)測表明，美國佛羅里達州北部地區(qū)的草地貪夜蛾種群對氟胺氰菊酯、甲基對硫磷和西維因分別產(chǎn)生了216, 271和192倍抗藥性(Yu, 1991)，同樣，中部和南部地區(qū)的草地貪夜蛾種群對上述3種殺蟲劑也分別產(chǎn)生了高達264, 517和507倍抗性(Yu, 1992)。隨后Bt抗蟲基因作物得到廣泛應用，然而隨著草地貪夜蛾對Bt作物不斷產(chǎn)生抗性，導致在南美洲大部分地區(qū)仍需要使用大量殺蟲劑對草地貪夜蛾進行防控，其中以使用雙酰胺類、多殺菌素等新型化學殺蟲劑為主(Burtetetal., 2017)。但Gutiérrez-Moreno等(2019)報道發(fā)現(xiàn)，波多黎各的草地貪夜蛾田間種群已對雙酰胺類殺蟲劑氟蟲雙酰胺和氯蟲苯甲酰胺分別產(chǎn)生了500倍和160倍的高水平抗性，對乙基多殺菌素也產(chǎn)生了14倍的中等水平抗性，但對甲維鹽仍處于低水平抗性。

草地貪夜蛾對化學殺蟲劑的抗藥性機制是復雜且不斷進化的，其中代謝抗性和靶標抗性是主要的抗性機制。乙酰膽堿酯酶 (acetylcholine esterase, AChE) 基因Ace-1是有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的作用靶標。Carvalho等(2013)研究發(fā)現(xiàn)，與敏感品系相比，在巴西通過室內(nèi)選育的草地貪夜蛾毒死蜱抗性品系的Ace-1基因在A201S, G227A和F290V位點均發(fā)生了點突變，這些位點突變在其他昆蟲中已被證實是對有機磷類殺蟲劑產(chǎn)生抗性的重要原因。電壓門控鈉通道(voltage-gated sodium channels, VGSC)是擬除蟲菊酯類殺蟲劑的作用靶標，VGSC基因T929I, L932F和L1014F位點突變被證實可引起kdr抗性，且在小菜蛾Plutellaxylostella中更可引起super kdr抗性。魚尼丁受體(ryanodine receptor, RyR)是雙酰胺類殺蟲劑的作用靶標，RyR基因點突變最早在小菜蛾中被報道是其對雙酰胺類藥劑產(chǎn)生抗性的主要機制，隨后在番茄潛葉蛾Tutaabsoluta和二化螟Chilosuppressalis中也有相關報道(Guoetal., 2014; Roditakisetal., 2015; Yaoetal., 2017)。在小菜蛾中，RyR基因G4946E和I4790M位點的突變是其對氯蟲苯甲酰胺產(chǎn)生抗性的重要機制(Guoetal., 2014; Yanetal., 2014)。Boaventura等(2019)研究表明，RyR基因I4743M和G4891E位點的突變是草地貪夜蛾對雙酰胺類藥劑產(chǎn)生抗性的主要機制。

盡管國外已報道草地貪夜蛾對有機磷類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類以及一些新型化學殺蟲劑都產(chǎn)生了不同程度的抗性，但是由于草地貪夜蛾剛入侵我國，其對常見防治藥劑的敏感性水平尚不知曉。因此，為明確湖北草地貪夜蛾田間種群的藥劑敏感性現(xiàn)狀，本研究根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《農(nóng)藥管理條例》推薦的25種用于應急防控草地貪夜蛾的藥劑(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部, 2019)，選擇了湖北省草地貪夜蛾防治的4種主打藥劑，對湖北草地貪夜蛾田間種群對這4種殺蟲劑的敏感性進行測定，并利用分子檢測方法對有機磷類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類和雙酰胺類藥劑的作用靶標Ace-1,VGSC和RyR的點突變進行檢測。研究結果可為湖北草地貪夜夜蛾防治藥劑的選擇提供參考，并對全國草地貪夜蛾的科學防控具有重要現(xiàn)實意義。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

草地貪夜蛾田間種群分別采自湖北省黃岡市、武穴市、咸寧市和荊州市，具體采樣信息見表1。田間種群采集后帶回實驗室，經(jīng)室內(nèi)形態(tài)檢查確定為草地貪夜蛾后，使用人工飼料飼養(yǎng)，選取第1代繁殖孵化后代的3齡初幼蟲作為室內(nèi)生物測定試驗蟲源。人工飼料主要成分為黃豆粉、玉米粉和酵母粉等。羽化后的成蟲飼養(yǎng)在長×寬×高=30 cm×30 cm×30 cm的養(yǎng)蟲籠內(nèi)，成蟲用10%的蜂蜜水補充營養(yǎng)。

表1 湖北省4個地區(qū)玉米田草地貪夜蛾田間種群采集信息Table 1 Sampling data of Spodoptera frugiperda populations from corn fieldsin four regions of Hubei Province, central China

1.2 供試藥劑

60 g/L乙基多殺菌素懸浮劑(spinetoram SC)(美國陶氏益農(nóng)公司)；95%甲維鹽(methylamino abamectin benzoate)原藥(內(nèi)蒙古嘉寶仕生物科技股份有限公司)；98%氯蟲苯甲酰胺(chlorantraniliprole)原藥(山東濰坊潤豐化工股份有限公司)；95%茚蟲威(indoxacarb)原藥(湖北威德刊化學科技有限公司)。

1.3 生物測定方法

參照NY/T 1154.14-2008，采用浸葉法進行生物測定。原藥用丙酮與N-N二甲基甲酰胺的混合溶劑(1∶4, v/v)配制成母液，隨后用含0.1%(v/v)Triton X-100的蒸餾水稀釋6～7個濃度梯度。以含0.1%(v/v)Triton X-100的蒸餾水作對照。取幼嫩的玉米葉，經(jīng)過清洗晾干后，剪成8～9 cm葉段，浸漬藥液中漂洗10 s后取出，每個藥液浸24段，在室內(nèi)干燥通風環(huán)境晾干后，每段平均分為3小段，置于底層鋪有2 mL 2%瓊脂凝膠的12孔細胞培養(yǎng)板中，每孔2～3小段。挑選體表圓潤，行為活潑的經(jīng)過4 h 饑餓處理的3齡初幼蟲，投入十二孔板，每孔1頭，使用兩層宣紙封口并蓋上培養(yǎng)板蓋。將12孔板置于25±1℃、相對濕度60%、光周期16L∶8D的人工氣候箱飼養(yǎng)。每處理重復3次。根據(jù)藥劑作用特點于24 h檢查乙基多殺菌素和氯蟲苯甲酰胺結果，48 h檢查茚蟲威和甲維鹽結果，統(tǒng)計死亡率。試蟲死亡判斷標準：使用毛筆尖輕觸蟲體，不能正常爬行視為死亡。對照組死亡率在10%以下為有效試驗。乙基多殺菌素制劑使用清水稀釋，設置清水作為對照。

1.4 總RNA提取及反轉錄

用RNAiso Plus試劑盒(大連寶生物，大連)提取單頭3齡草地貪夜蛾幼蟲總RNA，用NanoPhotometer超微量分光光度計(IMPLEN, 德國)檢測RNA的純度及濃度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取RNA的完整性。

檢測合格的總RNA用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)反轉錄試劑盒(大連寶生物，大連)反轉錄為cDNA，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 靶標位點突變檢測

根據(jù)報道的引物序列，擴增草地貪夜蛾Ace-1基因(GenBank登錄號: KC435023)和RyR基因 (GenBank登錄號: MK805909.1)片段，并檢測其靶標位點突變情況(Carvalhoetal., 2013; Boaventuraetal., 2019)；利用Primer Premier 5軟件設計針對草地貪夜蛾VGSC基因(GenBank登錄號: KC435025)位點突變的特異性引物，擴增VGSC基因片段檢測其靶標位點突變情況。共檢測草地貪夜蛾80頭。引物序列見表2。

表2 靶標位點突變檢測引物序列Table 2 Primer sequences for detecting targetsite mutations

以單頭幼蟲cDNA為模板，進行PCR擴增，反應體系(20 μL): 2×高保真DNA聚合酶 10 μL, ddH2O 7 μL, 正反向引物各1 μL, cDNA模板1 μL。PCR反應條件: 95℃預變性3 min; 95℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 40 s, 35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物由1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶正確的PCR產(chǎn)物送北京擎科生物公司測序。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用POLO Plus 2.0軟件處理生測數(shù)據(jù)。使用Chromas 2.31軟件對測序峰圖進行分析，核對Ace-1,VGSC和RyR編碼蛋白在上述位置對應核苷酸是否發(fā)生點突變。用Excel記錄統(tǒng)計每個幼蟲個體的基因型以及每個種群的突變頻率。靶標基因突變頻率%=[(抗性純合子個體數(shù)/檢測總數(shù))+(抗性雜合子個體數(shù)/檢測總數(shù)/2)]×100%。

2 結果

2.1 生物測定結果

4種殺蟲劑對采自湖北黃岡、武穴、咸寧和荊州4個地區(qū)草地貪夜蛾3齡初幼蟲的室內(nèi)毒力測定結果見表3。結果表明，這4個種群對氯蟲苯甲酰胺、乙基多殺菌素、甲維鹽都較為敏感，其中對甲維鹽最敏感，LC50值為0.004～0.014 mg/L;其次是對乙基多殺菌素， LC50值為0.044～0.184 mg/L。對湖北4個種群氯蟲苯甲酰胺的LC50值為9.651～28.907 mg/L，表現(xiàn)出較好的毒力效果。在這4種藥劑中，茚蟲威毒力效果較差，LC50值為8.635～135.824 mg/L，其中武穴種群對茚蟲威較為敏感，LC50值為8.635 mg/L;茚蟲威對黃岡種群表現(xiàn)出較差的毒力效果，LC50值為135.824 mg/L。

表3 4種殺蟲劑對湖北草地貪夜蛾田間種群3齡初幼蟲的毒力Table 3 Toxicity of four insecticides to the early 3rd instar larvae of field populations of Spodoptera frugiperda in Hubei

CL: 置信限Confidence limit. 選用饑餓4 h的3齡初幼蟲，殺蟲劑處理24 h(乙基多殺菌素和氯蟲苯甲酰胺)或48 h(茚蟲威和甲維鹽)后檢測死亡率。The early 3rd instar larvae subjected to starvation for 4 h were treated with insecticides, and the mortality rate was determined at 24 h (spinetoram and chlorantraniliprole) or 48 h (indoxacarb and methylamino abamectin benzoate) post treatment.

2.2 Ace-1基因型和突變頻率分析

通過對Ace-1基因PCR擴增和測序共檢測湖北4個田間種群80頭幼蟲，通過序列比對和峰圖分析發(fā)現(xiàn)，Ace-1基因中與有機磷抗性相關的3個突變位點(A201S, G227A和F290V)在湖北草地貪夜蛾田間種群中均能檢測到，且F290V位點能夠檢測到抗性純合突變(圖1)。突變頻率分析表明，A201S和G227A位點只發(fā)生了抗性雜合突變，且發(fā)生頻率較低，突變頻率分別為5.3%～10.0%和5.3%～36.8%之間，純合敏感型分別占比94.7%～100%和63.2%～94.7%之間；而F290V位點既存在抗性雜合突變，又存在抗性純合突變，突變頻率分別為10.0%～68.4%和15.0～65.0%之間。種群分析表明，A201S位點突變在4個種群中的抗性基因頻率均較低，在咸寧和荊州種群中更是未檢測到抗性突變，G227A位點抗性基因頻率在2.7%～11.1%之間，而F290V位點抗性頻率較高，在荊州種群中抗性基因頻率甚至高達60.5%(表4)。

圖1 Ace-1基因A201S, G227A和 F290V位點測序峰圖Fig. 1 Sequencing chromatogram peaks of Ace-1 in the sites of A201S, G227A and F290V

表4 湖北4個田間種群草地貪夜蛾幼蟲Ace-1靶位點A201S, G227A和F290V突變的基因型及抗性基因頻率Table 4 Genotypes and resistance gene frequencies of target site mutation of Ace-1 at A201S, G227Aand F290V of Spodoptera frugiperda larvae from four field populations in Hubei

SS: 敏感型純合子Susceptible homozygote; RS: 抗性雜合子Resistant heterozygote; RR: 抗性純合子Resistant homozygote.

2.3 VGSC和RyR基因型和突變頻率分析

根據(jù)草地貪夜蛾VGSC基因序列(GenBank登錄號: KC435025)設計合成VGSC基因突變檢測引物Sf-VGSC-F和Sf-VGSC-R(引物序列見表2)；參照Boaventura等(2019)的報道合成RyR基因突變檢測引物Sf-G4946-F/Sf-G4946-R和 Sf-I4790-F/Sf-I4790-R。 對單頭草地貪夜蛾VGSC和RyR基因進行PCR擴增，目的片段長度為分別為614, 108和144 bp。測序結果分析表明，檢測的80頭樣本VGSC和RyR基因均未出現(xiàn)靶標位點突變(圖2)。

圖2 VGSC基因T929I, L932F和L1014F位點以及RyR基因I4743M和G4891E位點測序峰圖Fig. 2 Sequencing chromatogram peaks of VGSC at the sites of T929I, L932F and L1014F,and RyR at the sites of I4743M and G4891E

3 討論

草地貪夜蛾的入侵對我國玉米、小麥等糧食作物生產(chǎn)造成嚴重威脅，對其進行有效防控至關重要(徐麗娜等, 2019)。草地貪夜蛾作為一種暴發(fā)性害蟲，危害猖獗，防控形勢嚴峻，化學農(nóng)藥在草地貪夜蛾防控中發(fā)揮著重要的作用。本研究通過生物測定明確了采自湖北黃岡、武穴、咸寧和荊州的草地貪夜蛾田間種群對氯蟲苯甲酰胺、乙基多殺菌素、茚蟲威和甲維鹽的敏感性，結果表明湖北草地貪夜蛾田間種群對這4種殺蟲劑均較敏感。 毒力水平：甲維鹽>乙基多殺菌素>氯蟲苯甲酰胺>茚蟲威。結果與趙勝園等(2019)的研究結果一致，說明甲維鹽、乙基多殺菌素等殺蟲劑作為防治草地貪夜蛾的推薦藥劑(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部, 2019)可繼續(xù)在湖北草地貪夜蛾防治中進行使用。

有機磷類和氨甲甲酸酯類作為傳統(tǒng)化學殺蟲劑，在國外是最早用于草地貪夜蛾防治的藥劑。但由于長期不合理使用，目前草地貪夜蛾已對多種有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性(Carvalhoetal., 2013)。研究表明,AChE基因點突變導致的對有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的不敏感性是導致害蟲抗性產(chǎn)生的主要原因(Walshetal., 2001)。例如，巴西草地貪夜蛾種群對有機磷殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性與Ace-1基因A201S, G227A和F290V 3個位點突變有關(Carvalhoetal., 2013)。而最新研究表明，墨西哥草地貪夜蛾田間種群Ace-1基因同樣發(fā)生了點突變，但是只檢測到了A201S和F290V突變，并未檢測到G227A突變(Herrera-Mayorgaetal., 2019)。本研究通過對湖北草地貪夜蛾4個種群80頭幼蟲樣本的檢測發(fā)現(xiàn)，這些樣本中Ace-1基因不但在A201S, G227A和F290V 3個位點發(fā)生了抗性雜合突變，在F290V位點還存在15.0%～65.0%的抗性純合突變。這一結果與Herrera-Mayorga等(2019)報道僅發(fā)現(xiàn)兩個位點突變的結果稍有差異，可能是由于抗性水平差異導致的。我們所測的草地貪夜蛾樣本中Ace-1基因在A201S, G227A和F290V位點均發(fā)生突變，該突變可降低其對有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的敏感性，因此，在草地貪夜蛾田間防治時，建議少用或不用這兩類藥劑，避免更高水平抗性的產(chǎn)生。

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥在國外是繼有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥之后，使用最廣泛的一類農(nóng)藥，對草地貪夜蛾具有較好的防效，在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布的草地貪夜蛾應急防治用藥名單中有高效氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、甲氰菊酯等多種單劑和復配制劑。害蟲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑抗性的產(chǎn)生與靶點不敏感性有關(Liuetal., 1981; Yu, 1993; Tan and McCaffery, 1999)。擬除蟲菊酯類殺蟲劑的作用靶標是VGSC，VGSC基因發(fā)生突變引起的殺蟲劑抗藥性在桃蚜Myzuspersicae、棉蚜Aphisgossypii等多種昆蟲中都有報道，如桃蚜VGSCIIS6跨膜區(qū)的L1014F和M918T位點突變是桃蚜對擬除蟲菊酯類和DDT產(chǎn)生抗藥性的主要原因(Martinez-Torresetal., 1999; Bassetal., 2014)，而棉蚜M918T突變是其對多種擬除蟲菊酯類殺蟲劑產(chǎn)生抗藥性的關鍵(Chenetal., 2017)。已有報道發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾擬除蟲菊酯抗性品系VGSC發(fā)生了T929I, L932F和L1014F位點突變，但突變頻率相對較低(Carvalhoetal., 2013)。本研究通過對湖北4個草地貪夜蛾種群VGSC檢測發(fā)現(xiàn)，80頭個體均不存在VGSC突變。但Zhang等(2019)對入侵我國16省份的105個草地貪夜蛾樣品的VGSC突變檢測發(fā)現(xiàn)，L932F位點存在45.5%的雜合突變。這一結果的差異可能是由于檢測種群的差異造成，本研究僅對湖北4個種群80個個體進行檢測，而Zhang等(2019)的樣本來源范圍更大，且個體數(shù)也較多。根據(jù)本研究結果，建議在湖北草地貪夜蛾防控中可以繼續(xù)使用農(nóng)業(yè)部推薦的擬除蟲菊酯類藥劑進行田間防治。

雙酰胺類農(nóng)藥是一類作用于昆蟲的魚尼丁受體的化學殺蟲劑，對多種害蟲都具有較好的防效，被廣泛應用于各種鱗翅目害蟲的化學防治中。但近年來，多種害蟲對雙酰胺類殺蟲劑已產(chǎn)生了極高水平的抗藥性(Wang and Wu, 2012; Guoetal., 2014)?？剐詸C制研究表明鱗翅目害蟲對雙酰胺類殺蟲劑的抗性機制與魚尼丁受體靶標位點突變有關(Troczkaetal., 2012; Guoetal., 2014; Nauenetal., 2016)。例如，魚尼丁受體基因I4743M位點發(fā)生了純合突變的斜紋夜蛾Spodopteraexigua田間種群，對氯蟲苯甲酰胺產(chǎn)生了高達154倍的高水平抗性(Zuoetal., 2019)。在草地貪夜蛾中，其對雙酰胺類農(nóng)藥產(chǎn)生抗藥性的機制與RyRI4743M和G4891E位點突變有關(Boaventuraetal., 2019)。本研究在湖北草地貪夜蛾田間種群中并未檢測到RyR靶標位點突變，這與生測結果中湖北草地貪夜蛾田間種群對氯蟲苯甲酰胺敏感性較高的結果一致。值得注意的是，到目前為止，國內(nèi)還沒有報道發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾田間種群RyR存在靶標突變。因此，建議在草地貪夜蛾的田間防治過程中可繼續(xù)使用雙酰胺類殺蟲劑。

化學殺蟲劑在草地貪夜蛾的防治中扮演著重要作用。本研究結果明確了湖北草地貪夜蛾田間種群對4種殺蟲劑的敏感性現(xiàn)狀，且明確了有機磷類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類和雙酰胺類殺蟲劑作用靶標的突變情況，研究結果對指導湖北草地貪夜蛾防治具有重要實踐意義。