劉露 翟啟明 張青 劉安琪 劉文佳 金鈁

脫落乳牙牙髓干細胞(SHED)取自人類自然更替的乳牙牙髓，具有高度增殖能力；且來源于神經(jīng)嵴的外胚間充質(zhì)，又具有胚胎早期間充質(zhì)干細胞的優(yōu)良性能，是組織工程技術中理想的種子細胞[1-2]。SHED具有多向分化能力，可以成牙本質(zhì)，成牙髓、成骨、成脂、成神經(jīng)甚至成肝細胞分化等[1]；有廣泛的應用前景，如常用于牙髓牙周再生[3]、顱骨頜骨缺損[4]及皮膚損傷[5]等的治療，更因其為神經(jīng)嵴來源，在神經(jīng)損傷修復方面具有獨特的優(yōu)勢，也可用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療[6-7]。脊髓屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分，脊髓損傷后可引起不同節(jié)段的癱瘓，給患者和家人帶來極大痛苦，因此對它的治療意義重大；然而目前臨床上對脊髓損傷尚無有效療法[8]，對此探究任重道遠。

本實驗室在前期研究中已初步證實SHED聚合體有可能成為治療大鼠脊髓損傷的新療法，且SHED聚合體的療效要優(yōu)于UCMSCs聚合體[9]；本研究想通過聯(lián)合治療來進行療效優(yōu)化，探究基于SHED聚合體的治療大鼠脊髓損傷的更優(yōu)療法。大量實驗研究中應用干細胞懸液顯微注射，創(chuàng)造有利于脊髓損傷恢復的微環(huán)境進行治療[10-11]?？紤]到在脊髓損傷區(qū)植入的SHED聚合體也需要有利于其存活及發(fā)揮作用的微環(huán)境，且SHED在細胞來源、神經(jīng)營養(yǎng)因子、細胞因子分泌及免疫調(diào)節(jié)等方面具有很大優(yōu)勢[12]，猜想聯(lián)合SHED細胞懸液注射或許能最大限度地激發(fā)SHED對脊髓損傷的修復潛能。因此，本實驗擬探究聯(lián)合SHED細胞懸液注射是否能有效提高SHED聚合體治療大鼠脊髓損傷的療效。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

α-MEM培養(yǎng)基(Gibco,美國)； 胎牛血清FBS(杭州四季青生物工程材料有限公司)； 膠原酶、維生素C、 1%戊巴比妥鈉， 4%多聚甲醛， TritonX-100(Sigma,美國)； GFAP抗體、NF抗體(CellSignalingTechnology, 美國)； MBP抗體、HuNu抗體、Fluor488二抗(Abcam, 英國)； Cy3IgG二抗(Jackson,美國)； BDNF、NT-3、NGF的ELISA檢測試劑盒(R&D Systems,美國)； Hamilton微量注射器(Hamilton， 5 μl，瑞士)； WPI顯微注射系統(tǒng)(武漢微科精密儀器有限公司)； EndeavorCR術中脊髓監(jiān)護儀(廣州尼高力科學儀器公司)； 冰凍切片機(Leica，德國)； 激光共聚焦顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 實驗動物

健康雌性SD大鼠28 只(180～200 g)，由第四軍醫(yī)大學動物實驗中心提供，動物實驗程序符合本校動物使用及管理委員會規(guī)定。

1.3 SHED聚合體的培養(yǎng)

將P5代SHED以3×105個/孔的密度接種于12 孔板中，細胞融合率達85%左右時棄去原培養(yǎng)液，換成含VC(50 μg/ml)的α-MEM培養(yǎng)液，隔天換液，培養(yǎng)7 d左右即可形成聚合體(具體方法參見已發(fā)表文章[9])。聚合體培養(yǎng)成熟后立即進行體內(nèi)移植治療。

1.4 SHED細胞懸液的制備

選用P5代SHED，接種至培養(yǎng)皿，當細胞融合率約達90%時，消化離心重懸，調(diào)成細胞濃度為1×105個/μl的細胞懸液。

1.5 大鼠全橫斷脊髓損傷模型建立及分組治療

建模：去除大鼠T8、T9椎板，在暴露的T8-9脊髓的中間部位用顯微剪進行全橫斷損傷，之后均勻剪除一段脊髓組織，形成2 mm間隙。脊髓全橫斷后大鼠后肢癱瘓。

治療：間隙內(nèi)可植入SHED聚合體。損傷脊髓的兩斷端可聯(lián)合SHED懸液注射，注射位點：距損傷斷端約2～3 mm,中線兩側(cè)各2 mm處進針，注射深度1.5 mm,每個位點注射2.5 μl(1×105個/μl)。

實驗分組: ① SHAM組(n=6)：僅去除T8、T9椎板； ② SCI only組(n=6)：僅建模不治療； ③ SHED-CA組(n=8)：建模后，在2 mm間隙內(nèi)移植SHED聚合體治療并在其表面用纖維蛋白膠覆蓋； ④ SHED-CA+SHED組(n=8)：建模后，在2 mm間隙內(nèi)移植SHED聚合體且表面覆蓋纖維蛋白膠，并在脊髓損傷兩斷端聯(lián)合SHED懸液注射治療。

1.6 SHED治療大鼠全橫斷脊髓損傷的觀察指標

1.6.1 行為學評分(BBB評分) 術后每周進行BBB評分檢測，觀察大鼠后肢運動功能的恢復情況。將大鼠逐只放至開放場地中，每只5 min，根據(jù)BBB評分標準由至少兩名實驗員進行盲評。 0 分為完全癱瘓， 21 分為正常。

1.6.2 大鼠脊髓組織免疫熒光染色 第12周末，大鼠心臟灌注后，取損傷區(qū)脊髓組織包埋做冰凍切片，并對GFAP、MBP、NF等神經(jīng)源性標志物進行免疫熒光染色。加入一抗過夜后，加入熒光二抗避光孵育，染核，封片，于激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。所用一抗：GFAP(兔源)1∶300，MBP(兔源)1∶1 000， NF(兔源)1∶1 000，HuNu(小鼠來源) 1∶500； 二抗：Fluor488(驢抗兔)1∶800， Cy3IgG(羊抗小鼠)1∶300。

1.6.3 脊髓損傷后BDNF、NT-3、NGF分泌的ELISA檢測 分別于第1、 4和12 周結(jié)束時各組隨機選取1 只大鼠，用生理鹽水心臟灌注后迅速從脊髓損傷區(qū)取出長約2 cm的脊髓組織，用勻漿器及RIPA裂解液制備脊髓組織勻漿，提取上清液進行ELISA檢測(具體檢測方法參見試劑盒說明書)。

1.7 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism和SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析，兩獨立樣本均數(shù)比較采用t檢驗，多樣本均數(shù)比較采用ANOVA方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 BBB評分

大鼠全橫斷脊髓損傷后，雙后肢完全癱瘓。SCI only組未進行治療，BBB評分前3 周基本為0，之后有一定恢復但最高不超過3 分。SHED-CA組和SHED-CA+SHED組與SCI only組比，后肢運動功能均有明顯恢復，分別于第7 周、 第10 周進入平臺期；且從第4 周起聯(lián)合SHED懸液注射組的療效要好于單純SHED聚合體治療組，至第9～12 周時有明顯統(tǒng)計學差異(P<0.05)(圖 1)。

2.2 脊髓組織免疫熒光染色結(jié)果

GFAP(圖 2)：星形膠質(zhì)細胞標記物，脊髓損傷后參與瘢痕組織形成，而瘢痕組織會阻礙軸突再生。SCI only組出現(xiàn)大量陽性標記，而SHED-CA組僅有極少量陽性標記，SHED-CA+SHED組則幾乎無陽性標記。表明：SHED-CA可有效減少瘢痕形成，且聯(lián)合SHED懸液注射后能更好地抑制瘢痕形成。GFAP與移植細胞HuNu共定位結(jié)果顯示陰性，表明：所移植的SHED細胞沒有出現(xiàn)向星形膠質(zhì)細胞的分化。

圖 1 大鼠后肢運動功能BBB評分(*:P<0.05)

Fig 1 BBB scores of the locomotor function of rats' hind limbs(*:P<0.05)

MBP(圖 3)：髓鞘即少突膠質(zhì)細胞的標記物，主要分布于細胞漿膜面。脊髓損傷后髓鞘細胞多壞死、凋亡，相應的SCI only組幾乎無陽性標記。SHED-CA+SHED組有較多明顯的陽性標記，而SHED-CA組僅有少量陽性標記，表明：SHED聚合體聯(lián)合SHED懸液注射比單純SHED聚合體治療有更好的髓鞘保護作用或能再生修復髓鞘損傷。且SHED-CA+SHED組與移植細胞標記HuNu共定位顯示有極少量陽性，說明：SHED聚合體治療可能促進了內(nèi)源性髓鞘細胞再生，其自身并沒有出現(xiàn)向髓鞘細胞的直接分化，但聯(lián)合SHED懸液注射可能有助于SHED分化為髓鞘細胞。

圖2 GFAP與HuNu免疫熒光共染 (左：×10， 右：×200)

Fig 2 GFAP and HuNu co-staining with immunofluorescence staining (Left: ×10; Right: ×200)

圖3 MBP與HuNu免疫熒光共染 (左：×10， 右：×200)

Fig 3 MBP and HuNu co-staining with immunofluorescence staining (Left: ×10， Right: ×200)

NF(圖4)：神經(jīng)纖維標記物，呈絲線狀分布。脊髓損傷后大量神經(jīng)纖維壞死、凋亡，SCI only組幾乎無陽性標記。經(jīng)治療后，SHED-CA+SHED組有較多明顯的陽性標記，SHED-CA組有少量陽性標記，說明：SHED聚合體聯(lián)合SHED懸液注射對神經(jīng)纖維的修復效果更好。但與移植細胞HuNu共定位結(jié)果顯示陰性，表明：SHED可能并不是通過直接分化成神經(jīng)元而發(fā)揮作用，可能促進了固有脊髓神經(jīng)元的內(nèi)源性再生。

2.3 脊髓損傷后BDNF、NT-3、NGF分泌的ELISA檢測結(jié)果

神經(jīng)營養(yǎng)因子的存在對脊髓損傷修復、軸突生長及再生、突觸形成及重組等起著關鍵性作用。脊髓損傷后BDNF、NT-3、NGF這3 種神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌量在1 周以內(nèi)有少量增加，隨后迅速減少， 4 周后即降到較低水平；而用SHED進行治療后，有效促進了它們的分泌，且SHED聚合體聯(lián)合SHED懸液注射的效果更好：相同時間點SHED-CA+SHED組分泌量一直是最多的，且在第12 周時與SHED-CA組比有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；雖然4 周后它們的分泌量均逐漸減少，但聯(lián)合SHED懸液注射組降低幅度更小。

3 討 論

有實驗已證明SHED可有效修復脊髓損傷，使其有較好的功能恢復，他們采用的是SHED細胞懸液注射治療，或SHED復合外源性支架材料的組織工程方法治療[13-14]；而本課題組創(chuàng)新性地發(fā)現(xiàn)SHED聚合體治療脊髓損傷更是有不錯療效[9]； 并且為探究基于SHED聚合體的具有更佳療效的療法，本實驗采用聯(lián)合治療的方法進行研究?？紤]到不同的移植途徑可能發(fā)揮不同的作用：懸液注射治療的細胞更容易遷徙及分泌各種因子，可能對局部微環(huán)境的調(diào)控起到作用；而聚合體更好地保存了細胞間天然分子連接及物理、化學、生物信息，有利于細胞間信號傳遞并行使功能；故本實驗采用聯(lián)合SHED懸液注射的方法來探究能否提高SHED聚合體的療效。

本研究動物實驗結(jié)果顯示：BBB評分發(fā)現(xiàn)聯(lián)合SHED懸液注射可有效提高SHED聚合體治療大鼠脊髓損傷的療效，第4周之后逐漸明顯，尤其第9～12 周有顯著統(tǒng)計學差異，最高評分達12 分，也高于同類研究中的BBB評分值(8 分)[9,14]。免疫熒光染色結(jié)果顯示與單純SHED聚合體治療組相比，聯(lián)合SHED懸液注射可更好地抑制瘢痕組織形成，并使髓鞘及神經(jīng)纖維出現(xiàn)再生修復；且與HuNu共定位結(jié)果顯示聯(lián)合SHED懸液注射有助于SHED分化為髓鞘細胞，促進神經(jīng)纖維再髓鞘化。同時神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌的檢測結(jié)果顯示SHED聚合體治療可明顯增加BDNF、NT-3、NGF的分泌，且聯(lián)合SHED懸液注射增加量更多。BDNF、NT-3主要可增加運動神經(jīng)元的存活，而NGF對早期感覺功能的發(fā)育及存活作用較大[15]，這也與本研究關注的大鼠運動與感覺功能有明顯恢復這一現(xiàn)象相契合。

圖4 NF與HuNu免疫熒光共染 (左：×10， 右：×200)

Fig 4 NF and HuNu co-staining with immunofluorescence staining (Left:×10， Right:×200)

圖 5 術后第1、 4、 12 周BDNF、 NT-3、 NGF分泌的ELISA檢測

Fig 5 BDNF, NT-3 and NGF secretion detected by ELISA at 1， 4 and 12 weeks after operation

最終本研究得出初步結(jié)論：聯(lián)合SHED懸液注射能明顯提高SHED聚合體治療大鼠脊髓損傷的療效。本研究采用早期的SHED細胞，并在誘導成聚合體時采用高濃度培養(yǎng)，以減少體外培養(yǎng)時間，盡量保持其神經(jīng)嵴來源的特性；之后未經(jīng)成神經(jīng)誘導而直接植入脊髓損傷后的環(huán)境中，使其得到自然誘導。同時在脊髓損傷斷端聯(lián)合SHED懸液注射，使其分泌的多種因子能有效調(diào)節(jié)局部微環(huán)境，促進軸突再生。本研究推測，有如此好的療效是因為：SHED懸液注射促進分泌更多的神經(jīng)營養(yǎng)因子，創(chuàng)造有利于脊髓損傷恢復的微環(huán)境，除了促進內(nèi)源性脊髓再生，SHED自身也向髓鞘細胞方向分化，從而重建神經(jīng)傳導通路，使得運動和感覺功能有明顯恢復。

本實驗通過聯(lián)合SHED懸液注射的方式，探究到了基于SHED聚合體的治療大鼠脊髓損傷的更為有效的療法，充分探究了SHED在中樞神經(jīng)損傷修復方面的應用，也為臨床治療脊髓損又提供一條新思路。本研究發(fā)現(xiàn)SHED可能通過向髓鞘細胞分化及旁分泌機制創(chuàng)造有利于脊髓損傷恢復的微環(huán)境而發(fā)揮作用，不過具體機制還有待深入討論。而且實驗動物與人類實際情況相差還很大，仍需要大量工作去探究此方法在更高級動物甚至人體上的可行性及有效性。