段夢露，李 皎，鄧 媛，毛 勇，楊國武

(陜西省微生物研究所,陜西 西安 710043)

0 前言

β-環(huán)糊精( β-cyclodextrin，β-CD) 是由 7 個 D-吡喃葡萄糖基以 α-1，4 葡萄糖苷鍵連接成的環(huán)狀低聚糖。它具有中心疏水、外表面親水的圓臺形桶狀空間結(jié)構(gòu)，因此能夠包埋疏水性分子或者基團從而形成包合物[1]。 經(jīng)過環(huán)糊精包埋以后的分子或基團的理化性質(zhì)，比如水溶性、穩(wěn)定性、揮發(fā)性等都會發(fā)生改變，達到保護、穩(wěn)定、增溶客體分子的功能，所以β-CD廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、石油、化工、環(huán)保等諸多領(lǐng)域[2～4]。

β-CD由β-CGTase作用于淀粉后使葡萄糖基發(fā)生轉(zhuǎn)移反應(yīng)而獲得[5]，是具有高附加值的淀粉深加工產(chǎn)物，目前國內(nèi)主要以玉米淀粉為生產(chǎn)原料。β-CGTase的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)大部分采用嗜堿性芽孢桿菌純培養(yǎng)完成[6～8]。在生產(chǎn)初期，由于培養(yǎng)條件的強堿性(pH>9)，發(fā)酵染菌的幾率極低。但是長時間連續(xù)生產(chǎn)導(dǎo)致環(huán)境中的嗜堿性菌群增加，生產(chǎn)廠家發(fā)酵染菌的現(xiàn)象越來越多，雜菌污染可能導(dǎo)致產(chǎn)品酶活降低，產(chǎn)量下降，從而直接影響生產(chǎn)效益，嚴(yán)重的已經(jīng)發(fā)生連續(xù)倒罐，生產(chǎn)停滯，嚴(yán)重增加了企業(yè)的生產(chǎn)成本和負擔(dān)[9,10]。

我們團隊多年來致力于研究環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)工藝，研究水平已處于國際領(lǐng)先水平。我們在對生產(chǎn)廠家進行技術(shù)服務(wù)過程中，在發(fā)酵異常的發(fā)酵液中分離到了一株在堿性條件下可以和正常生產(chǎn)菌共生的節(jié)桿菌，通過16sDNA分析發(fā)現(xiàn)該雜菌為節(jié)桿菌Arthrobacter sp.AMP-5。對生產(chǎn)過程進行實時監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)該菌優(yōu)先于生產(chǎn)菌進行發(fā)酵，形成優(yōu)勢菌群并降低發(fā)酵液pH值，進而抑制生產(chǎn)菌的增殖。由于β-CGTase生產(chǎn)屬于正壓發(fā)酵，發(fā)酵污染的來源可能是空氣過濾系統(tǒng)或菌種污染，因此通過預(yù)先鑒定生產(chǎn)菌種以及凈化空氣過濾系統(tǒng)，可以防止發(fā)酵染菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 菌株H02S：從生產(chǎn)廠家發(fā)酵異常的發(fā)酵液中分離得到嗜堿性蠟狀芽孢桿菌：陜西省微生物研究所保藏β-CGTase生產(chǎn)菌種其他試劑購自市售。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 全自動立式電熱壓力蒸汽消毒器(YX-400ZN，上海三申醫(yī)療器械有限公司)；生物發(fā)酵智能控制系統(tǒng)及GUJS-10發(fā)酵罐(鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(GH-600ASB，上海博訊實業(yè)有限公司)；恒溫培養(yǎng)搖床(ZHWY-2012，上海智誠分析儀器制造有限公司)；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀(S1000，美國bio-rad公司)；水平式核酸電泳槽；紫外儀(WD-9430F，北京六一儀器制造廠)；小型震蕩儀(QL-901Vortox, 海門其林貝爾儀器制造有限公司)；精密臺式數(shù)顯pH計(PB-10，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；722N型分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵液酶活測定方法 采用碘液法測定β-CGTase 水解活性[11]。取 10 μL發(fā)酵液與0.2 mL Tris-HCl緩沖液(pH8.0)混合，再加入0.25%馬鈴薯淀粉溶液0.2 mL，振蕩，于40℃水浴中反應(yīng)10 min 后，立即置于冰水浴中并加入0.5 molc 醋酸溶液 0.5 mL 終止反應(yīng)，再加入 3 mL 0. 05 g ·L-1碘液顯色，同時以蒸餾水為空白，不加酶液為對照，在700 nm波長下比色。一個酶活力單位定義為每分鐘減低 10% 吸光度所需酶量。

一個酶活單位(U)=(a-b)/a×1000×酶液稀釋倍數(shù)

式中：a 為對照組的吸光度；b為樣品的吸光度。

1.2.2 發(fā)酵液光密度測定方法 吸取發(fā)酵液2 mL，以蒸餾水定容到50 mL，在單色波長600 nm處測得光密度值。

1.2.3 雜菌的篩選和分離 分離培養(yǎng)基：玉米漿(6%)，七水硫酸鎂(0.02%)，磷酸氫二鉀(0.1%)，馬鈴薯淀粉(1.5%)，瓊脂(2%)，溶解后調(diào)pH到7.0，加入無水碳酸鈉1%。

篩選培養(yǎng)基：以分離培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，加入0.03%酚酞。

取發(fā)酵液按10的倍數(shù)逐級梯度稀釋，分別在分離培養(yǎng)基和篩選培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。

1.2.4 采用16srDNA技術(shù)進行菌種分析、鑒定 提取菌種的基因組DNA。根據(jù)細菌的16S rDNA的保守性，設(shè)計通用引物序列為，F(xiàn)：5-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3；R：5- TAC GGC TACCTTGTTACG ACTT-3，以基因組DNA為模板，PCR擴增程序為：95℃熱變性5 min；94 ℃/40 s，55℃/40 s，72℃/2 min，40個循環(huán)；72℃延伸 10 min，1.0 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。目的片段經(jīng)膠回收和純化后，連接于 pGM-T 載體上，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞E．coli DH5α中， 37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落培養(yǎng)并使T7和SP6測序引物進行菌落 PCR驗證 。PCR條件：95℃熱變性10 min；94℃/1 min，55℃/1 min，72℃/2 min，共 30個循環(huán) ；72℃延伸 10 min。將驗證后的陽性克隆子菌液送至楊凌天潤奧科生物科技有限公司測序。使用BLAST搜索軟件在NCBI的GeneBank基因庫中對測序結(jié)果進行同源性分析和檢索，篩選出與目的菌種相似度匹配最高的種屬。

2 結(jié)果與討論

2.1 H02S菌種的分離篩選

對環(huán)糊精生產(chǎn)車間中發(fā)酵異常的發(fā)酵液進行分離篩選， 獲得一株可在強堿性(pH>9)的篩選培養(yǎng)基上正常生長的菌種H02S。如圖1所示，1為將一片蓋玻片置于培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)基和pH試紙分離，試紙不變色，進一步證實了本實驗試紙的顯色是由堿性培養(yǎng)基引起的，與環(huán)境因素?zé)o關(guān)。菌落2為產(chǎn)β-CGTase的正常菌菌落，該菌落可在堿性培養(yǎng)基上正常生長(pH試紙顯色為堿性)，且菌落周圍產(chǎn)生褪色圈，這是由于正常菌產(chǎn)生的β-CGTase將培養(yǎng)基中的淀粉轉(zhuǎn)化為β-CD，β-CD包埋培養(yǎng)基中的酚酞從而在菌落周圍產(chǎn)生了褪色圈。菌落3為分離雜菌H02S，該雜菌雖然可在強堿性培養(yǎng)基上生長(pH試紙顯色為堿性)，但不能生產(chǎn)分泌β-CGTase，所以菌落周圍無褪色圈。

2.2 H02S菌種的16SrDNA分析

對H02S進行16SrDNA克隆和測序，使用BLAST在GeneBank基因庫中進行同源性搜索和多序列比對，如圖2所示，經(jīng)比對H02S應(yīng)歸屬于Arthrobacter sp.AMP-5，與正常生產(chǎn)菌種屬不同。

2.3 H02S菌種發(fā)酵生長曲線

將正常菌和H02S雜菌分別接入10 L全自動發(fā)酵罐，以相同培養(yǎng)條件進行發(fā)酵，并記錄兩種菌的發(fā)酵生長曲線。如圖3所示，在0～8 h之間，兩種菌的生長速度幾乎相同，隨后8～16 h之間雜菌H02S的生長速度高于正常菌，且雜菌在16 h菌體密度達到峰值，而生長至16 h之后，正常菌的菌體密度超過雜菌H02S。由此分析，在工業(yè)生產(chǎn)中，如果發(fā)酵罐染菌，雜菌會優(yōu)先于生產(chǎn)菌進行發(fā)酵，形成優(yōu)勢菌群從而抑制正常生產(chǎn)菌的生長，導(dǎo)致發(fā)酵失敗。

2.4 H02S菌種發(fā)酵pH值變化曲線

將正常菌和H02S雜菌分別接入10 L全自動發(fā)酵罐，以相同培養(yǎng)條件進行發(fā)酵，并記錄兩種菌發(fā)酵過程中的pH值變化。如圖4所示，兩種菌的發(fā)酵過程中pH值均呈現(xiàn)先下降后略有上升的趨勢。由此分析，在工業(yè)生產(chǎn)中可能H02S優(yōu)先于生產(chǎn)菌進行發(fā)酵，使發(fā)酵液pH值降低，不利于正常生產(chǎn)菌的增殖，并且增加了污染環(huán)境中其他雜菌的可能性。

2.5 H02S菌種發(fā)酵過程中的酶活變化

將正常菌和H02S雜菌分別接入10 L全自動發(fā)酵罐，以相同培養(yǎng)條件進行發(fā)酵，并記錄兩種菌發(fā)酵過程中的酶活的變化。如圖5所示，正常生產(chǎn)菌的酶活在28 h達到峰值4 257.41 U·mL-1，而H02S則不產(chǎn)酶。

3 結(jié)論

本團隊在對β-CGTase生產(chǎn)廠家進行技術(shù)服務(wù)過程中，在發(fā)酵異常的發(fā)酵液中分離到了一株在堿性條件下可以和正常生產(chǎn)菌共生的雜菌H02S；對該雜菌進行16srDNA基因分析鑒定，發(fā)現(xiàn)該雜菌為節(jié)桿菌Arthrobacter sp.AMP-5；將該雜菌與正常生產(chǎn)菌分別進行發(fā)酵，在發(fā)酵初期雜菌H02S的生長速度明顯高于正常菌，同時pH值快速下降，且發(fā)酵全程H02S不產(chǎn)酶。根據(jù)多年生產(chǎn)經(jīng)驗，由于β-CGTase生產(chǎn)屬于正壓發(fā)酵，發(fā)酵污染的來源可能是空氣過濾系統(tǒng)或菌種污染，導(dǎo)致了節(jié)桿菌優(yōu)先于正常菌生長，迅速形成優(yōu)勢菌群，消耗大量營養(yǎng)物質(zhì)，同時降低了發(fā)酵液pH值，抑制正常菌的生長導(dǎo)致發(fā)酵失敗。因此，在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)β-CGTase時，應(yīng)預(yù)先采用16srDNA基因序列分析鑒定生產(chǎn)菌種，排除染雜菌的菌種；發(fā)酵崗位操作員也應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行空消和實消操作，定期排空空氣壓縮機儲罐內(nèi)積水，對發(fā)酵過程中的酶活和pH值進行實時監(jiān)測，以期及早發(fā)現(xiàn)發(fā)酵污染，并從源頭上消除發(fā)酵染菌的可能性。