韓 航， RAMES Kaewmanee， SYED Asadullah， 沈?qū)W寧， 潘泳康， 錢 軍， 王雪紅， 魏 杰

（華東理工大學超細材料制備與應(yīng)用教育部重點實驗室，上海 200237）

聚醚醚酮（PEEK）是一種特種高分子材料，由于其具有耐高溫、自潤滑、耐磨損和抗疲勞等優(yōu)良性能，已成為當今最熱門的高性能工程塑料，主要應(yīng)用于航空航天、汽車工業(yè)、食品加工、電子電氣和醫(yī)療器械等領(lǐng)域[1]。由于具有無毒、質(zhì)輕、耐腐蝕、生物相容性良好、力學強度高以及彈性模量與骨組織相近等優(yōu)點，PEEK 作為骨修復(fù)材料在臨床上（如顱/頜面、脊柱、關(guān)節(jié)等修復(fù)領(lǐng)域）得到了廣泛的應(yīng)用[2,3]。但PEEK 是生物惰性材料，缺乏生物活性，不能與骨組織形成良好的骨整合，容易導致植入體松動，甚至手術(shù)失敗[4]。因此，對PEEK 進行表面改性，提高其生物活性受到了廣泛的關(guān)注[5]。

介孔硅酸鈣鎂（m-MCS）是一種具有納米孔道的生物活性玻璃，其比表面積大、孔容高[6]。體內(nèi)外實驗研究表明[7,8]：m-MCS 在生理環(huán)境中可釋放出一定濃度的硅、鈣、鎂離子，這些離子能夠刺激細胞增殖、分化和相關(guān)基因表達，以及促進骨組織再生。盡管m-MCS 具有優(yōu)良的生物相容性和生物活性，但其存在力學強度低、脆性大等缺點。因此，前期研究制備了PEEK/m-MCS 復(fù)合材料，使之兼具m-MCS 優(yōu)良的生物活性和PEEK 優(yōu)良的力學性能。結(jié)果顯示：隨著m-MCS 含量的增加，復(fù)合材料的力學強度和生物活性明顯提高，能顯著促進成骨細胞黏附、增殖與分化[9,10]。

飛秒激光（FSL）技術(shù)是一種應(yīng)用前景廣闊的微納結(jié)構(gòu)制造技術(shù)，能在材料表面高效構(gòu)建可控的微納結(jié)構(gòu)，已廣泛應(yīng)用于微光學、微電子學、材料學等領(lǐng)域[11]。FSL 技術(shù)具有加工操作簡單、尺寸精度高、掃描速率快、加工過程中材料表面氧化程度小等優(yōu)點，能在多種材料（包括金屬、陶瓷、玻璃和高分子）表面制備各種微納結(jié)構(gòu)（如凹槽、凸起、凹坑等）[12]。利用FSL 技術(shù)在材料表面構(gòu)建微納圖案來調(diào)控細胞行為（如黏附、形態(tài)、增殖和分化等）是一個很有前景的研究領(lǐng)域[13-15]。因此，本研究采用FSL 技術(shù)在PEEK/m-MCS 復(fù)合材料表面制備不同寬度的微溝槽，研究其對大鼠間充質(zhì)干細胞（rBMSCs）響應(yīng)行為的影響，有關(guān)該方面的研究尚鮮見報道。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

PEEK：醫(yī)藥級，江門市優(yōu)巨新材料有限公司；無水乙醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；牛血清白蛋白（BSA）：w = 98%，上?；鄯f生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）：w = 98%，上海撫生生物科技有限；μBCA 試劑盒：分析純，Thermo Scientific 公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）：優(yōu)級純，Thermo Scientific 公司；含血清MEM 培養(yǎng)基：w = 10%，Sigma-Aldrich 公司；電鏡專用戊二醛固定液：w = 2.5%，NOVON Scientific 公司；CCK-8試劑盒：分析純，上海翊圣生物科技有限公司；異硫氰酸熒光素標記鬼筆環(huán)肽（FITC-phalloidin），4'，6'-二脒基-2-苯基（DAPI）：w ＞ 95%，Sigma-Aldrich 公司；堿性磷酸酶（ALP）檢測試劑盒：分析純, 碧云天生物技術(shù)有限公司；SD 大鼠：上海杰思捷動物實驗有限公司。

1.2 測試與表征

采用傅里葉變換紅外光譜儀（美國Thermo Electron 公司Nicolet 6700 型）分析樣品的組成，掃描波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1；采用掃描電子顯微鏡（日本日立公司S-4800 型）觀察樣品表面的微觀形貌，測試前對樣品進行噴金處理；采用激光共聚焦3D 顯微鏡（日本基恩士公司VK-X110 型）觀察樣品表面的3D 形貌，采用物鏡（20×）掃描樣品表面不同位置，通過計算機輔助圖像分析材料的表面粗糙度（Ra）；采用酶標儀（中國普朗醫(yī)療DNM-9606 型）檢測樣品表面細胞的吸光度；采用激光共聚焦顯微鏡（日本尼康公司Nikon AIR 型）觀察樣品表面的細胞形態(tài)。

1.3 復(fù)合材料表面的飛秒激光改性

根據(jù)先前的研究[10]制備m-MCS 粉末，將PEEK 粉末和m-MCS 粉末按質(zhì)量比3∶2 混合，然后將混合粉末置于不銹鋼模具中，采用壓片機制備圓盤形樣品（Φ12 mm × 2 mm），隨后在馬弗爐中燒結(jié)4 h（燒結(jié)溫度為350 ℃），將獲得的PEEK/m-MCS 復(fù)合材料（PM）表面進行拋光，超聲清洗備用。由于rBMSCs 完全鋪展后，其尺寸一般在25～40 μm。采用飛秒激光放大器在復(fù)合材料表面根據(jù)細胞尺寸大小制備微溝槽寬度分別為20 μm（PM20）、40 μm（PM40）和60 μm（PM60）的樣品，溝槽深度均為15 μm，飛秒激光加工的參數(shù)為：脈沖寬度＜ 200 fs，中心波長為800 nm，重復(fù)頻率為1 kHz，掃描速率為600～1 000 μm/s。

1.4 蛋白吸附實驗

將樣品置于24 孔板中，向每孔中添加1 mL 的BSA 溶液（質(zhì)量濃度為10 mg/mL）。在37 ℃下靜置4 h后，用PBS 輕輕洗滌樣品3 次，去除松散吸附的蛋白質(zhì)。然后將樣品置于w = 5%的SDS 中，在37 ℃下晃動以釋放緊緊吸附的蛋白質(zhì)。收集含有蛋白質(zhì)的溶液，用μBCA 試劑盒定量測定蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)吸附結(jié)果以每單位質(zhì)量樣品吸附BSA 的質(zhì)量表示（mg 蛋白質(zhì)/g 樣品）。

1.5 細胞實驗

采用CCK-8 試劑盒，考察rBMSCs 在樣品表面的黏附情況。從鼠齡21～28 d，體重70～120 g 的SD 大鼠（雌雄不限）四肢中提取rBMSCs，采用第3～5 代細胞進行體外細胞實驗。將樣品先用去離子水清洗，再用高壓滅菌鍋滅菌后置于24 孔培養(yǎng)板中，將rBMSCs（1 mL 溶液中約含2 × 104個細胞）接種到樣品表面。將培養(yǎng)板置于37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中，于6、12 h 和24 h 分別將樣品取出放入新的培養(yǎng)板中，每孔中加入400 μL 新鮮培養(yǎng)基和40 μL CCK-8 溶液，空白對照組做相同的處理。在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，然后從每孔內(nèi)吸取100 μL 液體轉(zhuǎn)入96 孔板中，做好標記，最后用酶標儀分別在450 nm 和650 nm（參比波長）處測定吸光度（OD）。

采用CCK-8 試劑盒，考察rBMSCs 在樣品表面的增殖情況。將細胞在樣品上培養(yǎng)1、3 d 和7 d，去除MEM 培養(yǎng)基，用PBS 輕洗3 遍樣品表面以除去殘余液體，然后用戊二醛固定細胞；在避光條件下，加入FITCphalloidin（每孔200 μL），細胞骨架染色20 min 后用PBS 洗5 遍；接著加入DAPI （每孔200 μL），細胞核染色10 min 后用PBS 洗5 遍；采用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞骨架形態(tài)及細胞的鋪展情況。將細胞在樣品上培養(yǎng)1、3 d 和7 d，取出樣品置于新培養(yǎng)板中，在CCK-8 溶液中孵育4 h 后用酶標儀分別在450 nm 和650 nm 處測定OD。

通過檢測樣品表面培養(yǎng)細胞的ALP 活性來評價其成骨分化情況。將細胞接種在樣品上，待細胞全部黏附在樣品表面后，更換成成骨誘導培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d 更換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)7、10 d 和14 d 后進行ALP活性測定，ALP 活性定義為405 nm 處的吸光度值與總蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)之比。在特定時間點，吸去舊培養(yǎng)基，加入細胞裂解液浸沒樣品，放入37 ℃恒溫震蕩箱中孵育90 min。加入μBCA 試劑，以牛血清白蛋白作為標準蛋白質(zhì)，在波長562 nm 下測定裂解物中的總蛋白質(zhì)含量。向裂解物中先加入100 μL ALP 工作溶液反應(yīng)20 min，然后加入100 μL NaOH 溶液（0.1 mol/L）終止反應(yīng)。使用酶標儀在波長405 nm 下測定吸光度。

1.6 統(tǒng)計學分析

所有實驗至少進行3 次，獲得的數(shù)據(jù)均通過OriginPro 8.0（美國，OriginLab Corporation）軟件進行處理。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差（M ± SD），n = 3。 通過單因素方差（ANOVA）分析和Tukey 檢驗進行統(tǒng)計學分析。當p ＜ 0.05 時，結(jié)果具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 飛秒激光改性復(fù)合材料表面的FT-IR 分析

圖1 為m-MCS、PEEK、PM 和PM60 的FT-IR譜圖。m-MCS 在1 095 cm-1和799 cm-1處出現(xiàn)了Si―O―Si 反對稱伸縮振動峰。對于PEEK，1 652 cm-1處的峰歸屬于C=O 羰基伸縮振動帶，1 597 cm-1和1 501 cm-1處為R―O―R 苯環(huán)平面內(nèi)振動峰，1 308 cm-1處為R―CO―R 苯環(huán)平面內(nèi)振動峰，1 226 cm-1處為R―O―R 不 對 稱 伸 縮 振 動 峰， 929 cm-1處為R―CO―R 對稱伸縮振動峰，1 163 cm-1處為C―H在芳環(huán)中的面內(nèi)彎曲振動峰，840 cm-1和764 cm-1處為 C-H 苯環(huán)外彎曲振動峰[16]。對于PM 和PM60，可以觀察到m-MCS 和PEEK 的特征峰。這些結(jié)果表明：經(jīng)過飛秒激光改性后，PM60 表面沒有出現(xiàn)新的特征峰，其組成結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化。

2.2 復(fù)合材料表面不同寬度微溝槽的3D 形貌及粗糙度

圖2（a～c）為 PM20、PM40 和PM60 的激光共聚焦3D 顯微鏡照片。飛秒激光在復(fù)合材料表面形成了周期性的微溝槽，溝槽寬度分別為20、40 μm 和60 μm（溝深均為15 μm）。圖2（d）為圖2（c）中白色箭頭所指區(qū)域的粗糙度表征。溝槽脊（Area1）的粗糙度為（1.53 ±0.21） μm，溝槽內(nèi)表面（Area2）的粗糙度為（5.15 ± 0.35） μm。以上研究表明：復(fù)合材料經(jīng)飛秒激光精確而超快燒蝕后，其表面的PEEK 被氣化，形成微溝槽，內(nèi)表面暴露大量的m-MCS，粗糙度明顯增加。當生物材料表面粗糙度在1.12～5.70 μm 時，有利于成骨細胞附著，而且細胞在材料表面的黏附隨其粗糙度增加而提高[17]。

圖1 m-MCS、PEEK、PM 和PM60 的FT-IR 譜圖Fig. 1 FT-IR spectra of m-MCS, PEEK, PM and PM60

圖2 PM20（a）、PM40（b）和PM60（c）的激光共聚焦3D 顯微鏡照片，（d）為（c）中白色箭頭所指區(qū)域的粗糙度（*代表p ＜ 0.05）Fig. 2 Laser confocal 3D micrographs of PM20（a）, PM40（b） and PM60（c）；（d）Surface roughness of the area indicated by the white arrow in （c） （* Represents p ＜ 0.05）

2.3 復(fù)合材料表面不同寬度微溝槽的微觀形貌

圖3 （a～d）為 PM20、PM40 和PM60 的SEM 照片。飛秒激光在復(fù)合材料表面構(gòu)建了寬度為20、40 μm和60 μm 的微溝槽，且不同寬度微溝槽的內(nèi)表面均為微納結(jié)構(gòu)，沒有明顯區(qū)別。從圖3（d）中可以看出，PM60微溝槽內(nèi)表面為微米絲狀結(jié)構(gòu)，這是由于表面PEEK 被激光燒蝕，暴露出大量含有納米孔的m-MCS 顆粒。

圖3 PM20（a）、PM40（b）和PM60（c, d）表面微觀形貌的SEM 照片F(xiàn)ig. 3 SEM images of PM20（a）, PM40（b） and PM60（c, d）

2.4 微溝槽寬度對蛋白吸附及細胞黏附的影響

圖4 （a）為樣品對牛血清白蛋白的吸附性。PM、PM20、PM40 和PM60 對蛋白質(zhì)的吸附量分別為（0.29 ±0.10），（0.83 ± 0.08），（1.42 ± 0.09） mg/g 和（1.73 ± 0.08） mg/g。隨著微溝槽寬度的增加，蛋白質(zhì)的吸附量增加。圖4（b）為rBMSCs 在樣品表面培養(yǎng)不同時間后的黏附情況。培養(yǎng)6 h，細胞在PM20 和PM40 表面的黏附量沒有顯著性差異；培養(yǎng)12、24 h，細胞在PM40 表面的黏附量顯著高于PM20 和PM；在所有的時間點，PM60表面細胞的黏附量最高。

圖4 （a）樣品在BSA 溶液中浸泡24 h 后的蛋白吸附量；（b）rBMSCs 在樣品表面培養(yǎng)不同時間的細胞黏附情況Fig. 4 （a） BSA protein adsorption on samples after soaking in BSA solution for 24 h; （b） rBMSCs adhesion on the samples after cultivated for different time

這是由于隨著溝槽寬度增加，暴露的m-MCS 顆粒增多，具有微納結(jié)構(gòu)和高粗糙度的內(nèi)表面積就增大，復(fù)合材料表面的親水性（m-MCS 具有高親水性）就增高[9]，這些表面特征有利于蛋白質(zhì)吸附，而蛋白質(zhì)吸附有利于細胞的早期黏附[17-20]。另外，微納結(jié)構(gòu)能夠為細胞提供更多的結(jié)合位點，在納米尺度上與細胞偽足相互作用，從而提高細胞的黏附性[21]。

2.5 微溝槽寬度對細胞生長行為的影響

圖5 rBMSCs 在PM、PM20、PM40 和PM60 表面培養(yǎng)后的細胞形態(tài)的激光共聚焦照片F(xiàn)ig. 5 Laser confocal photographs of the cell morphology of rBMSCs cultivated on the surface of PM, PM20, PM40 and PM60

圖5為rBMSCs 在樣品表面培養(yǎng)1 d（圖5（a））、3 d（圖5（b））和7 d（圖5（c））的激光共聚焦照片。從圖5（a）可以看出：細胞在PM 表面比較散亂；在PM20 表面，細胞也沒有明顯的生長取向；少量細胞在PM40 表面沿著溝槽生長，部分細胞黏附在溝槽脊上；大部分細胞在PM60 表面沿著溝槽定向生長，部分細胞有絲狀偽足伸出。由于微溝槽的內(nèi)表面具有微納結(jié)構(gòu)，并暴露大量的m-MCS 顆粒，其粗糙度和親水性明顯高于溝槽脊[9]，因此，細胞傾向沿著溝槽內(nèi)表面黏附和生長。當溝槽尺寸小于細胞尺寸時，不利于細胞沿著溝槽黏附和長入；當溝槽寬度為40 μm 時，溝槽的尺寸與細胞的尺寸相近，細胞傾向沿著溝槽生長；當溝槽寬度為60 μm 時，溝槽的尺寸略微大于細胞的尺寸，更加有利于細胞沿著溝槽定向生長。

從圖5（b）可以看出：細胞在PM 表面隨機生長；在PM20 表面，細胞沒有明顯的生長取向，也沒有明顯鋪展；在PM40 表面細胞沿著溝槽生長，并明顯鋪展，顯示細長條狀形貌；在PM60 表面細胞沿著溝槽生長，鋪展更好，多個細胞疊在一起定向生長。從圖5（c）可知：細胞培養(yǎng)7 d 后，大量細胞在PM40 和PM60 表面沿著溝槽定向生長。

2.6 微溝槽寬度對細胞增殖及分化的影響

圖6（a）為rBMSCs 在樣品表面培養(yǎng)不同時間的細胞增殖情況。結(jié)果顯示：在1、3 d 和7 d，與其他對照組相比，細胞在PM表面的吸光度都最低，表明細胞增殖最差；而細胞在PM60 表面的吸光度都最高，表明細胞增殖最好。圖6（b）為rBMSCs 在樣品表面培養(yǎng)不同時間的ALP 活性表達情況。ALP 通常被認為是細胞成骨分化的標志物[22]。結(jié)果顯示：在7、10 d 和14 d，與其他對照組相比，細胞在PM 表面的ALP 活性都最低，表明細胞成骨分化最低；而細胞在PM60 表面的ALP 活性都最高，表明細胞成骨分化最好。上述結(jié)果表明：微溝槽寬度越寬，越有利于細胞沿著溝槽增殖和成骨分化。

圖6 rBMSCs 在樣品表面培養(yǎng)不同時間后的細胞增殖情況（a）和ALP 活性（b）Fig. 6 Cell proliferation （a） and ALP activity （b） after rBMSCs cultivated on the surface of samples for different time

3 結(jié) 論

采用飛秒激光技術(shù)在PEEK/m-MCS 復(fù)合材料表面構(gòu)建了不同寬度（20、40 μm 和60 μm）的周期性微溝槽，其內(nèi)表面形成了微納結(jié)構(gòu)，暴露出大量的m-MCS 顆粒，表面粗糙度增加。隨著微溝槽寬度的增加，蛋白質(zhì)吸附量提高。微溝槽寬度明顯影響rBMSCs 的響應(yīng)行為，當微溝槽寬度為60 μm 時，復(fù)合材料表面顯著地促進了細胞黏附、增殖與分化，并且誘導細胞沿著溝槽方向生長。