任萬蘭， 張 馳， 周 嬌， 侯有明， 趙莉藺，*福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，閩臺(tái)作物有害生物生態(tài)防控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州5000；福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建省昆蟲生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州5000；中國科學(xué)院動(dòng)物研究所，農(nóng)業(yè)蟲鼠害綜合治理研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京000；中國科學(xué)院生物互作卓越創(chuàng)新中心，北京0009

松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus(Steiner and Buhrer)Nickle隸屬滑刃目Aphelenchida寄生滑刃科(滑刃科)Parasiaphelenchidae(Aphelenchidae)傘滑刃亞科Bursaphelenchiae傘滑刃屬(張星耀和駱有慶，2004)，是一種世界性重大入侵害蟲，在世界范圍內(nèi)引起嚴(yán)重的森林病害，特別是在亞洲和歐洲的國家(Futai，2008； Shinyaet al.，2013；Zhao&Sun，2017)。松材線蟲所引起的松材線蟲枯萎病，是松屬樹種最具破壞性的疾病之一，造成全球環(huán)境和經(jīng)濟(jì)損失總計(jì)達(dá)數(shù)千萬美元(Tóth，2011)。

在夏季，松材線蟲會(huì)經(jīng)過卵、2齡、3齡、4齡、成蟲各個(gè)階段，此為繁殖周期(L1—L4)。到秋末時(shí)，松材線蟲會(huì)遇到低溫、缺少食物、種群密度過大等不利環(huán)境，這時(shí)，松材線蟲會(huì)由繁殖周期進(jìn)入擴(kuò)散周期。松材線蟲會(huì)先形成擴(kuò)散型3齡(LⅢ)，當(dāng)遇到枯死在松樹里的溝脛天牛族的天牛幼蟲時(shí)，松材線蟲LⅢ就會(huì)形成擴(kuò)散型4齡(LⅣ)，LⅣ進(jìn)入溝脛天牛族天牛的氣管內(nèi)，隨著天牛羽化轉(zhuǎn)移到新的寄主上，危害寄主健康。松材線蟲在松墨天牛Monochamus alternatusHope氣管中被攜帶，兩者間會(huì)產(chǎn)生免疫互作(Zhouet al.，2018)。研究表明，攜帶松材線蟲的松墨天牛中，miR-14、miR279和miR-312表達(dá)量均顯著升高，其功能大多指向代謝、免疫等方面(寧靜等，2018)。

半乳凝集素與早期發(fā)育和組織再生、惡性腫瘤分期、侵襲性或轉(zhuǎn)移潛能、脂肪生成和Ⅱ型糖尿病、調(diào)節(jié)先天和適應(yīng)性免疫穩(wěn)態(tài)有關(guān)，以及對感染性和過敏性挑戰(zhàn)的反應(yīng)和癌癥方面起關(guān)鍵作用(Blidneret al.，2015； Craiget al.，2010； Fenget al.，2015；Hillet al.，2010； Liuet al.，2012； Pejnovicet al.，2013； Rabinovichet al.，2012； Vastaet al.，2004；Yanget al.，2011)。galectin既參與寄生蟲的形態(tài)維持、生長發(fā)育等過程，還與其寄生、在宿主內(nèi)存活及免疫調(diào)節(jié)功能有關(guān)(Haoet al.，2007； Kielet al.，2007； Kimet al.，2010； Wanget al.，2007； Younget al.，2004)，現(xiàn)已在多種寄生性線蟲中發(fā)現(xiàn)，如捻轉(zhuǎn)血矛線蟲Haemonchus contortusRud.、馬來絲蟲Brugia malayi(Brug)Buckley、絲狀網(wǎng)尾線蟲Dictyocaulus filariaRudolphi、哥斯達(dá)管圓線蟲Angiostrongylus costaricensisMorera and Cespedes、廣州管圓線蟲Angiostrongylus cantonensisChen。

松材線蟲的galectin-1基因在2011年首次被發(fā)現(xiàn)(Leeet al.，2011)，其結(jié)構(gòu)和功能的研究仍是空白。本實(shí)驗(yàn)純化了galectin-1蛋白，并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并檢測了其在松材線蟲不同齡期的表達(dá)量，為進(jìn)一步研究松材線蟲發(fā)育、免疫、與松墨天牛的免疫互作奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試線蟲

松材線蟲品系來自中國陜西，并在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)了數(shù)代。采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)平板培養(yǎng)灰葡萄孢，溫度25℃，無光照，7 d左右灰葡萄孢基本長滿平板培養(yǎng)基，接入大約500條松材線蟲，在同樣條件下培養(yǎng)線蟲，8 d左右松材線蟲將灰葡萄孢吃完，用帶有抗生素的磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)將松材線蟲沖出。

各個(gè)齡期的獲得:收集松材線蟲的卵，在水中培養(yǎng)24 h，發(fā)育成2齡幼蟲(L2)；將2齡線蟲接種到灰葡萄孢上培養(yǎng)24 h，得到同步化繁殖型3齡松材線蟲(L3)；2齡線蟲接種灰葡萄孢上，培養(yǎng)48 h，得到同步化繁殖型4齡松材線蟲(L4)；將2齡線蟲接種到長滿灰葡萄孢的PDA平板上，培養(yǎng)72 h，得到同步化成蟲松材線蟲。用貝爾曼漏斗法收集各個(gè)齡期線蟲。擴(kuò)散性3齡(LⅢ)來自安徽疫區(qū)樹木，用貝爾曼漏斗法檢出。擴(kuò)散性4齡(LⅣ)來自室內(nèi)天牛氣管中。

將所收集的繁殖型線蟲(Ln)、LⅢ和LⅣ線蟲離心(5000 r·min-1，5 min)，除去多余的 PBST，加入1 mL 35%的蔗糖，6000 r·min-1離心 6 min，將上層的線蟲轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入1 mL帶有抗生素的 PBST，7000 r·min-1離心7 min，除去 PBST，收集線蟲提RNA。

1.2 線蟲總RNA的提取，cDNA的合成

根據(jù)Trizol試劑盒(Thermo Fisher公司)說明書，提取各個(gè)齡期繁殖型線蟲(Ln)、LⅢ和LⅣ松材線蟲的 RNA，使用 cDNAFast Quant RT Kit(with gDNase)(TIANGEN公司)反轉(zhuǎn)試劑盒合成cDNA，并作為熒光定量PCR的模板。

1.3 galectin-1基因的擴(kuò)增和測序

根據(jù)NCBI上松材線蟲galectin-1基因的mRNA完整編碼序列(GenBank登錄號(hào):GU130138)，設(shè)計(jì)合成特異性引物Galec-F:GATGACTGAGGAAAAGAAAAC和Galec-R:GCTT GGGTTAATGGATCTGGATGCCAG(單下劃線為酶切位點(diǎn)EcoR1和Hind3)。使用Phusion High-Fidelity PCR Kit高保真DNA聚合酶(NEB公司)做載體PCR和目的基因片段PCR，反應(yīng)體系:cDNA模板 1 μL，上、下游引物各 1 μL，dNTP 混合液 0.4 μL，Taq 酶 0.2 μL，Taq 緩沖液4 μL，補(bǔ)充 ddH2O 至20 μL。 PCR 反應(yīng)條件:95 ℃1 min ；94 ℃30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，循環(huán) 40次；72 ℃ 5 min。 PCR產(chǎn)物經(jīng)l%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，送深圳華大基因科技有限公司測序鑒定。

1.4 基因的生物信息學(xué)分析

ProtParam(http:∥www.expasy.ch/tools/protparam.html)預(yù)測蛋白質(zhì)的分子量和等電點(diǎn)，Clustal Wprogram(http:∥www.clustal.org/clustal2/)進(jìn)行蛋白質(zhì)序列比對，TMHMM分析蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域(http:∥ www.cbs.dtu.dk/services/TMH-MM/)，SMART軟件(http:∥smart.embl-heidel berg.de/)分析蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域，PredictProtein(https:∥ppopen.Informatik.tu-muenchen.de/)預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，SWISS-MODEL軟件(https:∥swissmodel.expasy.org/)預(yù)測三級結(jié)構(gòu)和同源建模，在NCBI數(shù)據(jù)庫中對松材線蟲的galectin進(jìn)行氨基酸序列的同源性比對，下載線蟲的galectin的氨基酸序列，并用MEGA 7(neighbor-joining，NJ法)軟件在1000次bootstrap檢測后構(gòu)建進(jìn)化樹。

AB135-S型十萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；LC-20A型高效液相色譜（HPLC）儀（包括DGU-20A5R在線脫氣機(jī)、LC-20AT輸液泵、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20A柱溫箱、SPD-M20A紫外檢測器及LC-Solution色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，日本島津公司）；Multiskan MK3型全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Electron公司）；分樣篩（上虞市五四儀器廠）；TGL-16型高速離心機(jī)（金壇市中大儀器廠）；GRP-9270型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；HH-S型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州翔天實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

1.5 重組質(zhì)粒pET-28a-galectin-1的構(gòu)建

用雙酶切法處理目的基因與載體pET-28a，限制性內(nèi)切酶為EcoR1和Hind3，使用DNA Ligation Kit Ver.2.1(TaKaRa)試劑盒鏈接目的基因與載體，再將產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。把細(xì)胞均勻涂布在含卡那霉素(100 μg·mL-1)的LB平板上，篩選陽性克隆，陽性菌液送深圳華大基因科技有限公司測序鑒定。

1.6 重組galectin-1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

接種空載菌株和單克隆pET-28a-galectin-1重組質(zhì)粒菌株分別于5 mL的LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素 50 μg·mL-1)中，在溫度 37 ℃、轉(zhuǎn)速 200 r·min-1的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度分別為0、0.1、0.5和1.0 mmol·L-1，分別在 16、37 ℃ 誘導(dǎo) 16 h，5000 r·min-1離心 20 min，沉淀用 100 μL PBS 混勻，超聲破碎后，12000 r·min-1離心 10 min，收集上清和沉淀，SDS凝膠電泳后，考染30 min，脫色過夜，檢測樣品。采用鎳柱親和層析法純化蛋白。將上清和沉淀的蛋白收集做 western blot。首先將蛋白跑SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，在轉(zhuǎn)膜buffer浸泡20 min，轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜(PVDF membrane)上，在TBST浸泡10 min，使用快速封閉液封閉10 min，一抗為鼠抗His標(biāo)簽，其濃度為1∶5000，4℃，過夜孵育，使用TBST洗膜5 min，洗3次；再將二抗鼠抗，濃度為1∶10000，加到封閉液中搖床孵育2 h，再用TBST洗5 min，洗3次；用ECL顯色液均勻涂抹在PVDF膜上，在黑暗中靜止5 min，再用醫(yī)用X線膠片曝光，置于顯色液2 min，水洗，定影液2 min，洗凈晾干，掃描數(shù)據(jù)。

1.7 松材線蟲各個(gè)齡期galectin-1基因定量表達(dá)

使用Peimer premier 5.0設(shè)計(jì)galectin-1基因的熒光定量PCR引物以及β-actin基因的引物，序列如表1所示:

表1 引物信息Table 1 Primers used in this study

反應(yīng)體系:SybGreen 10 μL，Rox 0.4 μL，上、下引物各0.8 μL，ddH2O 6 μL，模板2 μL。 反應(yīng)條件:95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s；56 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s；40個(gè)循環(huán)。以L2作為對照，比較松材線蟲其他各個(gè)齡期的定量數(shù)據(jù)，采用2-△△Ct相對定量法計(jì)算相對表達(dá)量。使用SPASS軟件分析數(shù)據(jù)，分析方法為比較均值單因素方差。

2 結(jié)果與分析

2.1 松材線蟲的galectin-1基因序列及特點(diǎn)

擴(kuò)增松材線蟲的galectin-1基因并進(jìn)行測序分析，該序列與 NCBI上所提交的基因序列(GU130138.1)一致，松材線蟲galectin-1的 Genbank編號(hào)為ACZ13331.1，氨基酸殘基數(shù)為278，由ProtParam查詢可知該蛋白的理論分子質(zhì)量為31.87 ku，等電點(diǎn)為 6.27。

2.2 松材線蟲galectin-1蛋白的功能結(jié)構(gòu)域分析

由SMART軟件分析可知，松材線蟲galectin-1蛋白的功能結(jié)構(gòu)域有2個(gè)，即第10～141位氨基酸處的GLECT結(jié)構(gòu)域(CRD)和第147～276位氨基酸處的GLECT結(jié)構(gòu)域(CRD)，由5個(gè)氨基酸殘基的肽鏈接(圖1)。

圖1 松材線蟲galectin-1蛋白結(jié)構(gòu)域的預(yù)測Fig.1 Predicted domains in galectin-1 of B.xylophilus

2.3 松材線蟲galectin-1蛋白二級和三級結(jié)構(gòu)

由PredictProtein軟件分析可知，galectin-1蛋白的二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)卷曲占 54.35%，β折疊占45.65%，沒有α螺旋。使用SWISS-MODEL軟件對galectin-1蛋白同源建模，顯示出該蛋白主要由無規(guī)卷曲和β折疊組成，結(jié)果與Predict Protein軟件一致。每個(gè)半乳凝素中，2個(gè)CRD的結(jié)構(gòu)相似，每個(gè)CRD具有典型的半乳凝素折疊，該褶皺由反平行的β-折疊構(gòu)成，β-折疊由 β-三明治組合組成，沒有任何 α-螺旋(圖 2)。

圖2 松材線蟲galectin-1蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.2 Predicted tertiary structures of galectin-1 of B.xylophilus

2.4 松材線蟲galectin-1同源序列對比及系統(tǒng)發(fā)育樹

通過對松材線蟲galectin-1蛋白序列的blast與氨基酸系列分析(圖3)，發(fā)現(xiàn)松材線蟲與小卷蛾斯氏線蟲Steinernemacarpocapsae(Weiser)(TMS35925.1)的相似性最高，為84.36%；與鼠類圓線蟲Strongyloides rattiSandground(XP＿024498502.1)相似性為82.01%。以日本血吸蟲Schistosoma japonicumKatsurada為外群，用MAGE 7.0建立成系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，線蟲都聚集在一個(gè)大分支上，而小卷蛾斯氏線蟲、鼠類圓線蟲和秀麗桿線蟲Caenorhabditis elegans在同一個(gè)小分支上，與blast的結(jié)果一致。

圖3 松材線蟲與其他物種中g(shù)alectin-1蛋白氨基酸序列比對Fig.3 Alignment of galectin-1 amino acid sequences of B.xylophilus with other species

圖4 galectin-1與其同源基因基于氨基酸序列構(gòu)建的進(jìn)化樹(鄰接法)Fig.4 Phylogenetic tree of galectin-1 and its homologues based on amino acid sequences(neighbor-joining method)

2.5 松材線蟲galectin-1蛋白的原核表達(dá)和Western blot

鎳柱親和層析純化蛋白的Western blot結(jié)果與查詢所得蛋白分子質(zhì)量一致。通過構(gòu)建galectin-1/pET-28a重組表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化到DH5α宿主菌中，使用不同濃度的IPTG，分別在37、16℃條件下誘導(dǎo)16 h表達(dá)重組蛋白(圖5)，結(jié)果顯示，在37℃條件下，表達(dá)的galectin-1蛋白較多，沉淀中蛋白的含量比上清多，并且在有IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)的galectin-1蛋白會(huì)更多。

2.6 各個(gè)齡期松材線蟲galectin-1基因的定量表達(dá)

收集松材線蟲各個(gè)齡期的cDNA，做galectin-1基因的RT-qPCR，結(jié)果表明，相比繁殖型2齡，繁殖型3齡、繁殖型4齡、擴(kuò)散型3齡和擴(kuò)散型4齡的galectin-1基因表達(dá)量都高，并且呈顯著差異(n＝3，P＞0.05，t檢驗(yàn))，與雌、雄成蟲沒有顯著差異；擴(kuò)散型3齡與繁殖型3齡的表達(dá)差異顯著(n＝3，P＞0.05，t檢驗(yàn))，擴(kuò)散性4齡與繁殖型4齡沒有顯著差異，雌、雄成蟲之間沒有顯著差異(圖6)；擴(kuò)散型3齡中g(shù)alectin-1基因的表達(dá)量最高。

圖5 重組galectin-1蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與蛋白純化Fig.5 Recombinant galectin-1 protein induced expression and protein purification

圖6 松材線蟲各個(gè)齡期的相對表達(dá)定量Fig.6 Quantitative expression of relative expression of B.xylophilus at various ages

3 討論與結(jié)論

本文通過原核表達(dá)體系，表達(dá)和純化松材線蟲galectin-1的蛋白，并預(yù)測其蛋白結(jié)構(gòu)，通過與同源基因系統(tǒng)發(fā)育樹的分析及其在松材線蟲不同蟲齡的表達(dá)量，初步探討松材線蟲galecctin-1基因的可能生理功能。

松材線蟲的 galectin-1蛋白有 2個(gè) GLECT(CRD)結(jié)構(gòu)域，這2個(gè)結(jié)構(gòu)域可結(jié)合碳水化合物，從而發(fā)揮生長發(fā)育、免疫或其他生理功能。松材線蟲是一種植物寄生線蟲，其傳播需要與松墨天牛相互作用，而通過blast以及氨基酸序列比對，系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示，松材線蟲與動(dòng)物寄生線蟲更為接近，特別是昆蟲寄生線蟲小卷蛾斯氏線蟲，說明松材線蟲Gal-1的功能可能在與天牛相互作用時(shí)發(fā)揮作用。通過對松材線蟲各個(gè)齡期做實(shí)時(shí)熒光定量PCR，發(fā)現(xiàn) L2、L3、L4和 LⅢ的galectin-1 基因的表達(dá)量依次增高，可能與松材線蟲的生長發(fā)育有關(guān)；LⅢ和LⅣ表達(dá)量差異顯著，LⅢ的galectin-1基因含量最高，可能與天牛蛹室周圍的復(fù)雜環(huán)境有關(guān)，因?yàn)長Ⅲ受天牛幼蟲所產(chǎn)生的萜烯物質(zhì)吸引，從而聚集在天牛蛹室周圍(Zhaoet al.，2007)，而天牛蛹室周圍有許多真菌和細(xì)菌，環(huán)境復(fù)雜，線蟲從而產(chǎn)生更多的galectin-1提高免疫力。而LⅣgalectin-1基因表達(dá)量的減少可能與天牛的免疫逃避相關(guān)；雌雄成蟲表達(dá)量沒有差異，說明與性別無關(guān)。

從2011年發(fā)現(xiàn)松材線蟲的galectin-1基因，便再無其他報(bào)道。本研究克隆了松材線蟲的galectin-1基因，并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和各個(gè)齡期的RT-qPCR，通過原核表達(dá)的方式表達(dá)該蛋白，最終獲得了純化后的蛋白，為今后研究松材線蟲的galectin-1蛋白與松墨天牛之間的互作提供了參考，為松材線蟲的防治提供了新方向。