楊 帥 穆 蕾 楊悠悠 孫小杰 史曉媛 羅云敬 楊永壇

(北京工業(yè)大學(xué)1，北京 100124)

(中糧營養(yǎng)健康研究院；營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點實驗室2，北京 102209)

(SCIEX中國應(yīng)用支持中心3，北京 100015)

真菌毒素又名霉菌毒素，是一種由真菌在一定條件下產(chǎn)生的小分子次生代謝產(chǎn)物[1]。目前，人們已知的真菌毒素有400多種，其中大多數(shù)都有著致癌、致畸、致突變的“三致”作用，對人體及動物的健康危害極大，被世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)列為食源性疾病的3大根源，而我國真菌毒素污染情況不容樂觀[2]。

在實際生產(chǎn)生活中，加工、儲存不當(dāng)都有可能引起糧食作物、市售食品、飼料等發(fā)生霉變，造成真菌毒素污染[3，4]。根據(jù)調(diào)查顯示，引起我國小麥真菌毒素污染的主要是鐮刀菌毒素，其中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的檢出率在55%～100%；玉米赤霉烯酮(ZEN)的檢出率在5.9%～100%，超標(biāo)率達(dá)到38.6%[5]。為保障食品的質(zhì)量和安全性，國內(nèi)外紛紛制定了相關(guān)的法律法規(guī)，針對不同的食品基質(zhì)限制其中可能出現(xiàn)的真菌毒素種類及含量。我國GB 2761—2017針對小麥粉基質(zhì)中的黃曲霉毒素B1(AFTB1)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮進(jìn)行了含量限定要求[6]。然而毒素目標(biāo)物覆蓋的種類仍不夠全面；其次各國和地區(qū)的法規(guī)也忽視了毒素衍生物的潛在危害等問題。

目前，小麥粉基質(zhì)中的真菌毒素殘留主要集中在黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、伏馬毒素等幾大類[7]。檢測方法主要有液相色譜法[8-10]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[11-15]以及酶聯(lián)免疫法等[16，17]。樣品前處理方法則主要采用免疫親和柱凈化。該前處理方法的優(yōu)勢在于利用抗原抗體專一結(jié)合進(jìn)行樣品凈化，選擇性強，能夠?qū)Ｒ坏夭东@提取液中的目標(biāo)物，保證凈化效果以規(guī)避基質(zhì)復(fù)雜及易受干擾等問題。但同時也造成了方法應(yīng)用面狹窄，檢測成本昂貴的問題，不適用于一次性多類毒素篩查。因此，本研究嘗試通過提取試劑的優(yōu)化，開發(fā)適合小麥粉基質(zhì)中多類毒素的樣品前處理方法，并建立28種真菌毒素的快速篩查方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇；乙腈(色譜純)；甲酸(色譜純)；甲酸(98%)；超純水；黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTG2);黃曲霉毒素M1、M2標(biāo)準(zhǔn)溶液(AFTM1、AFTM2); T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液(T-2)；HT-2毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液(HT-2)；赭曲霉毒素A、B標(biāo)準(zhǔn)溶液(OTA、OTB)；伏馬毒素B1、B2、B3標(biāo)準(zhǔn)溶液(FB1、FB2、FB3)；嘔吐毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(DON、3-Ac-DON、15-Ac-DON、Niv)；3-葡萄糖苷化-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)溶液(DON-3-Glu)；渥曼青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液(Wor)；新茄病鐮刀菌烯醇標(biāo)準(zhǔn)溶液(Neo)；蛇形毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液(Dia)；雜色曲霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液(Ster)；玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液(ZEN)；α、β-玉米赤霉烯醇標(biāo)準(zhǔn)溶液(α-ZEL、β-ZEL)；玉米赤霉酮標(biāo)準(zhǔn)溶液(ZAN)；α、β-玉米赤霉醇標(biāo)準(zhǔn)溶液(α-ZAL、β-ZEL) 。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-30AD高效液相色譜儀；QTRAP 5500 三重四級桿質(zhì)譜儀；Allegra 64R臺式高速離心機；TTL-DCⅡ型氮吹儀；Mili Q超純水機；Dragon Lab QL902渦旋振蕩器；SB-3200DTDN 超聲波清洗器。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2.5 g小麥粉樣品(精確至0.01 g)于50 mL離心管中，加標(biāo)樣品根據(jù)需要加入標(biāo)準(zhǔn)溶液；加入10 mL提取液(乙腈/水/甲酸，80∶18∶2，渦旋振蕩1 min，超聲提取20 min，8 000 r/min 離心10 min，取4 mL上清液轉(zhuǎn)移至一潔凈試管，在40 ℃水浴下，氮氣吹干，最后加入1 mL復(fù)溶液(甲醇/水/甲酸，30∶70∶0.1)復(fù)溶，渦旋震蕩30 s，超聲溶解5 min，12 000 r/min離心10 min，取上層清液于樣品瓶中待測。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Shiseido-C18(100 mm×2.0 mm，3 μm)，進(jìn)樣量20 μL，流速0.3 mL/min；流動相：A相為0.1%甲酸/水溶液，B相為0.1%甲酸/甲醇溶液，正負(fù)離子模式洗脫梯度如表1所示。

表1 梯度洗脫程序

1.4.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)，離子源溫度：550 ℃；離子噴霧電壓：5 500 V(正模式)/-4 500 V(負(fù)模式)；氣簾氣：35 psi；氣體1：50 psi；氣體2：55 psi；采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式進(jìn)行檢測。質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜條件參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌毒素的分離優(yōu)化

由于28種真菌毒素目標(biāo)物的結(jié)構(gòu)性質(zhì)差異較大，為實現(xiàn)檢測靈敏度最優(yōu)，部分目標(biāo)物需在正模式下離子化，而另一部分需要在負(fù)模式下離子化，故需要將毒素目標(biāo)物分組，對樣品進(jìn)行正負(fù)模式下的兩次測定。流動相選用甲醇/水體系，向溶劑中加入適當(dāng)甲酸可以促進(jìn)毒素目標(biāo)物在正離子監(jiān)測模式下的電離，可改善峰型和靈敏度。經(jīng)優(yōu)化后，28種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖如圖1和圖2所示。

圖1 18種真菌毒素混標(biāo)的正模式MRM色譜圖

圖2 10種真菌毒素混標(biāo)的負(fù)模式MRM色譜圖

2.2 前處理方法優(yōu)化

本研究使用乙腈/水/甲酸體系對真菌毒素進(jìn)行提取，并對乙腈的比例進(jìn)行了優(yōu)化，如圖3所示。由于伏馬毒素的支鏈上通常會含有多個羧基，親水性較強，使用高有機相體系則會導(dǎo)致其回收率部分損失，故我國國家標(biāo)準(zhǔn)及目前其他伏馬毒素檢測方法中主要使用使用水含量較高的提取溶劑進(jìn)行提取[18，19]。但本實驗中，應(yīng)用乙腈/水/甲酸(50∶48∶2)進(jìn)行提取時，提取液中高比例的水會大量溶出基質(zhì)中的雜質(zhì)，造成方法靈敏度降低；其次，部分毒素的回收率也會顯著下降，以黃曲霉毒素B1為例，回收率會下降至60%以下。經(jīng)過優(yōu)化，使用乙腈/水/甲酸(80∶18∶2)提取液時，非極性較大的部分毒素如黃曲霉毒素、鐮刀菌屬毒素、赭曲霉毒素等均有較好的提取效率，同時，伏馬毒素的回收率仍維持在60%以上。綜合考慮，選取乙腈/水/甲酸(80∶18∶2)作為提取液，可以滿足對28種毒素目標(biāo)物進(jìn)行統(tǒng)一前處理并保證各目標(biāo)物的回收率的要求，回收率范圍為60%～110%。

圖3 兩種提取溶劑對于毒素目標(biāo)物回收率的影響

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 方法的線性關(guān)系；檢出限；定量限

取空白小麥粉基質(zhì)，按照優(yōu)化后的前處理方法進(jìn)行處理，得到空白基質(zhì)提取液。標(biāo)準(zhǔn)工作液使用空白基質(zhì)提取液配制，按照1.4中的條件進(jìn)行測定。以各毒素目標(biāo)物的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，定量離子峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。以3倍信噪比和10倍信噪比時對應(yīng)的目標(biāo)物峰面積計算濃度，確定方法對于各目標(biāo)物的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)，結(jié)果如表3所示。28種真菌毒素目標(biāo)物在其各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)大于0.997，定量限均低于我國規(guī)定的糧食中真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)，能夠滿足日常檢測的需求。

表3 線性方程；檢出限；定量限

表4 回收率和精密度結(jié)果(n=6)

2.3.2 方法回收率及精密度

取空白小麥粉樣品，選擇低；中；高三個濃度水平進(jìn)行加標(biāo)，每個加標(biāo)水平平行測定六次，計算六次加標(biāo)實驗的平均回收率以及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，見表4。由實驗結(jié)果可以看出，本方法回收率和精密度結(jié)果良好，回收率結(jié)果穩(wěn)定在60%～120%之間，RSD小于15%，符合GB/T 27404—2008的實驗室質(zhì)量控制規(guī)范要求。

2.4 實際樣品測定

根據(jù)本研究中建立的方法，對市場銷售的9個不同品牌的小麥粉進(jìn)行了真菌毒素測定，結(jié)果如表5所示。所全部9個試樣品中，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢出率為100%，3-葡萄糖苷化-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢出率為89%，雪腐鐮刀菌烯醇；玉米赤霉烯酮檢出率為56%，伏馬毒素檢出率為33%。其中，嘔吐毒素及其衍生物污染范圍廣，含量較高，是造成小麥粉真菌毒素污染的主要毒素，個別樣品中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量超過了國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761—2017中對小麥粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的限量要求(<1 000 μg/kg)，應(yīng)采取風(fēng)險防控措施。玉米赤霉烯酮、伏馬毒素在小麥粉中分布廣泛，也應(yīng)予以關(guān)注。

表5 小麥粉實際樣品測定結(jié)果/μg/kg

注：“ND”為未檢出。

3 結(jié)論

建立了同時檢測小麥粉中28種真菌毒素的快速篩查方法。樣品經(jīng)過乙腈/水/甲酸溶液進(jìn)行提取(80∶18∶2)，C18色譜柱進(jìn)行分離，以0.1%甲酸的甲醇水溶液作為流動相，采用多反應(yīng)檢測(MRM)模式進(jìn)行檢測，外標(biāo)法定量，可以實現(xiàn)28種真菌毒素的同時檢測。本法具有操作簡單；快速；成本低廉；毒素種類覆蓋范圍廣的優(yōu)點，檢出限和定量限均能滿足真菌毒素日常風(fēng)險檢測的需求，為小麥粉基質(zhì)中真菌毒素檢測提供了一種高通量、低成本、高效率的檢測方式。