李海燕 馬云翔 俞力月 孫 倩 張盛貴

(甘肅農(nóng)業(yè)大學，蘭州 730070)

辛烯基琥珀酸酐(OSA)可與淀粉反應形成含有親水和疏水基團的辛烯基琥珀酸淀粉酯，疏水基團的引入使OSA改性淀粉具有兩親特性[1]，可用作乳化劑、包封劑及脂肪替代品[2]。美國食品和藥物管理局允許OSA改性淀粉作為合法的食品添加劑，最大OSA添加水平為3.0%，取代度(DS)小于0.02[3,4]。由于OSA在水中的溶解度低，在淀粉顆粒中分布不均勻，滲入顆粒內(nèi)部受到阻礙[5]，導致反應僅限于淀粉表面[6,7]，DS較低(0.0164)[8]。多孔淀粉(PS)是用物理法、生物法和化學法使淀粉顆粒由表面至內(nèi)部形成孔洞的一種變性淀粉[9]，PS相比于原淀粉具有大的比表面積[10]。因此，相比于原淀粉，PS作為反應主體，不僅使反應時淀粉與OSA的接觸面積增加，又能使OSA滲透到淀粉的內(nèi)部而發(fā)生反應，獲得更高的取代度，提高改性淀粉的乳化能力和乳化穩(wěn)定性。

最近的一些研究已經(jīng)通過物理化學處理增加淀粉對OSA修飾的敏感性。Wang等[11]利用高速剪切的方法促進OSA與淀粉的酯化反應，使淀粉表面結構破壞，同時OSA液滴變小，使OSA更易進入淀粉顆粒內(nèi)部，從而使酯化反應更均勻的發(fā)生。Wang等[12]通過比較冷凍-解凍和水熱-堿的方法預處理淀粉，證明水熱-堿預處理增加了OSA-淀粉的DS和反應效率(分別為0.0185和79.7%)，冷凍-解凍預處理產(chǎn)生相反的結果(分別為0.015 2和65.5%)。Lu等[13]使用β-淀粉酶和轉(zhuǎn)葡糖苷酶對天然淀粉納米顆粒(NSP)進行酶預處理，然后用OSA酯化，結果表明雙酶預處理增加了OSA改性淀粉顆粒的DS，提高了乳液穩(wěn)定性。Xu等[14]利用脂肪酶催化OSA與淀粉的酯化反應，所得產(chǎn)物與水相法獲得的產(chǎn)物性質(zhì)相似，但可以縮短反應時間。淀粉在經(jīng)OSA改性前，通過物理化學方法將淀粉顆粒適度破壞，可增加OSA與淀粉的接觸面積，從而提高酯化反應的效率。

關于OSA改性多孔淀粉的結構性質(zhì)研究報道很少，研究淀粉的多孔結構對OSA改性淀粉的DS及性質(zhì)的影響鮮見報道。本研究通過OSA改性PS以獲得更高取代度但又符合食用標準的改性淀粉，以克服原淀粉取代度低、乳化能力和乳化穩(wěn)定性差的缺點。以多孔淀粉為主體，OSA為客體成功合成OSA改性多孔淀粉，采用SEM評價多孔淀粉的孔結構，固態(tài)核磁(13C CP/MAS NMR)和傅里葉紅外光譜(FT-IR)評價OSA與多孔淀粉的酯鍵，X射線衍射分析(XRD)評價OSA改性多孔淀粉的結晶結構，熱重分析(TGA)改性淀粉酯的熱穩(wěn)定性。研究OSA改性多孔淀粉的結構特性，旨在為淀粉的綜合利用提供借鑒，且為改性淀粉作為乳化劑遞送生物活性物質(zhì)提供選擇。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米淀粉、α-淀粉酶(AM，50 U/mg，分析純)、淀粉葡糖苷酶(AMG，100 U/mL，分析純)、辛烯基琥珀酸酐(分析純)、玉米油(試劑級)、β-胡蘿卜素。

1.2 儀器與設備

PHS-3C雷磁pH計；H-1850R臺式高速冷凍離心機；600 MHz 寬腔固體超導核磁共振波譜儀；NEXUS 670傅里葉變換紅外光譜儀；SuperNOVAX-射線單晶衍射儀；JSM-6701F冷場發(fā)射型掃描電鏡；DF-Ⅱ集熱式磁力加熱攪拌器；FJ-200高速均質(zhì)機。

1.3 方法

1.3.1 多孔淀粉(PS)的制備

參照Dura等[9]的方法稍做修改，具體方法如下：將玉米淀粉(10.0 g)懸浮于pH 4.5的磷酸鹽和醋酸鹽混合緩沖液中，于40 ℃水浴鍋中攪拌(100r/min)20 min，然后加入2%(相對于淀粉)、酶比(mAM:mAMG)為6∶1的復合酶，將樣品在50 ℃水浴中攪拌(50 r/min)。24h后加1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH為10.0以終止酶解反應。將懸浮液在7 000r/min，4℃下離心15 min，蒸餾水重復洗滌3次。最后，將收集的沉淀物置于恒溫干燥箱中50 ℃干燥8 h，研磨過90目篩存于干燥器中備用。

1.3.2 OSA改性多孔淀粉的制備

參照Song等[15]的方法并做適當修改，具體操作如下：將原淀粉或多孔淀粉(5.0 g)分散在水(30%)中，攪拌20 min以形成懸浮液。用3% NaOH溶液調(diào)pH至8.5，在1 h內(nèi)分別將淀粉質(zhì)量1%、3%和5%的OSA(用無水乙醇稀釋3倍)溶液緩慢滴加至淀粉漿中，35 ℃反應1 h，再用3% HCl溶液將pH調(diào)至6.5，離心混合物并用水洗2次，用70%乙醇洗滌2次，置于40 ℃干燥24 h，過90目篩備用。將改性淀粉分別命名為1% OSA-NS、1% OSA-PS、3% OSA-PS和5% OSA-PS。

1.3.3 OSA改性多孔淀粉取代度(DS)的測定

參照Kweon等[16]描述的滴定法測定DS，適當修改，具體操作為：OSA改性多孔淀粉(1g)置于20 mL HCl-異丙醇溶液(2.5 mol/L)中，攪拌30 min。加入90%異丙醇水溶液(100 mL)，攪拌10 min。將懸浮液離心，殘余物用90%異丙醇水溶液洗滌，直至用0.1 mol/L AgNO3測定不存在氯離子。將殘余物重新分散在蒸餾水(60 mL)中，沸水浴中加熱20 min。用酚酞作為終點指示劑，用0.1 mol/L標準NaOH溶液滴定混合物，多孔淀粉做空白對照。DS用公式計算：

式中：162為葡萄糖殘基的摩爾質(zhì)量/g/mol；210為辛烯基琥珀酸酐的摩爾質(zhì)量/g/mol；A為氫氧化鈉溶液的滴定體積/mL；M為氫氧化鈉溶液的濃度/mol/L；W為樣品質(zhì)量/g。

反應效率(RE)計算公式為：

1.3.4 OSA改性多孔淀粉結構表征分析

1.3.4.1 掃描電鏡分析(SEM)

用導電膠將少量干燥后的原淀粉、多孔淀粉和OSA改性多孔淀粉粉末粘在樣品座上，將樣品座置于離子濺射儀中鍍金30 s后，用掃描電鏡觀察樣品粉末的形態(tài)特征。

1.3.4.2 核磁共振分析(13C CP/MAS NMR)

使用AVANCE NEO WB 600核磁共振波譜儀在100.56 MHz下以13C參照純四甲基硅烷獲得多孔淀粉和OSA改性多孔淀粉的13C CPMAS NMR光譜。

1.3.4.3 傅里葉紅外光譜分析(FT-IR)

采用溴化鉀壓片法測定多孔淀粉及OSA改性多孔淀粉的紅外光譜。取適量溴化鉀，加入1 mg干燥樣品粉末，碾磨至無顆粒感后壓片處理，掃描波長為4 000 ～450 cm-1。

1.3.4.4 X射線衍射分析(XRD)

采用X射線衍射儀對多孔淀粉及OSA改性多孔淀粉結晶結構測定。測試條件為：掃描范圍535；掃描速度2/min；掃描步長0.06；掃描方式為連續(xù)。相對結晶度使用公式計算。

式中：Xc為相對結晶度；Ac為晶體面積；Aa為非晶體面積。

1.3.4.5 熱重分析(TGA-DTA)

采用熱重分析儀研究多孔淀粉及OSA改性多孔淀粉的熱特性。分析條件：氮氣；升溫速率10℃/min；溫度范圍20700 ℃。

1.3.5 乳化穩(wěn)定性分析

分別配制0.05 g/mL的多孔淀粉和OSA改性多孔淀粉溶液，加入β-胡蘿卜素玉米油，使混合物中含有5%的OSA改性多孔淀粉和10%的玉米油，用高速均質(zhì)機以500 r/min的速度均質(zhì)10 min后，再通過高壓均質(zhì)機在100 MPa下均質(zhì)兩次，吸取10 mL放入試管中，30 min后觀察試管中乳液的狀態(tài)并拍照。

1.3.6 統(tǒng)計分析

每組實驗重復3次，采用Origin 8及SPSS 22等軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)用平均值±標準差的形式表示。

2 結果與討論

2.1 OSA改性多孔淀粉的取代度(DS)

在淀粉濃度為30%，反應時間為1 h，溫度為35 ℃，pH值為8.5條件下對不同OSA水平處理的改性多孔淀粉進行DS分析(表1)。結果表明，1%OSA-PS的DS為0.0191，RE為82.11%，隨著OSA濃度的增加，DS也隨之增加，RE減小，原因是淀粉羥基數(shù)目固定，因此反應依賴于羥基附近OSA分子的可用性[17]，在OSA改性銀杏淀粉中也觀察到相似的結果[18]，而RE減小可能是由于水不溶性OSA和淀粉相混合不充分造成的[19]。Chen等[8]在3%OSA水平下利用水熱預處理淀粉，使得OSA改性淀粉的DS從0.0164上升到0.0190；Bai等[20]制備3%濃度的OSA改性玉米淀粉，DS為0.019。本實驗所測1%OSA改性原淀粉的DS為0.0130，1%OSA改性多孔淀粉DS為0.0191，DS和RE均不同程度的增加，這是由于多孔淀粉結構中孔徑和孔深度的增加提供了更大的比表面積[21]，與OSA有更多的反應位點，賦予酯化產(chǎn)物更大的取代度和反應效率。

表1 OSA改性多孔淀粉的DS和相對結晶度

注：不同的上標字母表明差異有統(tǒng)計學意義(P< 0.05)。

2.2 OSA改性多孔淀粉的結構表征

2.2.1 掃描電鏡分析(SEM)

天然玉米淀粉、多孔淀粉及OSA改性多孔淀粉的SEM顯示在圖1中。天然玉米淀粉(圖1a)表面平滑，顆粒呈圓形和多角形，且沒有可見的孔，表明在處理期間不存在內(nèi)源性酶。多孔淀粉(圖1b)表面出現(xiàn)較為均勻的孔，孔的深淺不一，有的孔可以延伸到顆粒內(nèi)部，但顆粒的形狀幾乎不變，可提供更大的比表面積，釋放更多的羥基基團與OSA發(fā)生反應[22]。在OSA酯化反應后，顆粒表面出現(xiàn)輕微腐蝕，但不影響顆粒的原始形狀[17]，多孔結構仍能保持。SEM結果表明，酯化反應不會破壞多孔淀粉顆粒的形態(tài)結構。

圖1天然玉米淀粉、多孔淀粉及OSA改性多孔淀粉電鏡掃描圖

2.2.2 固態(tài)核磁分析(13C CP/MAS NMR)

對多孔淀粉和OSA改性多孔淀粉進行13C CP/MAS NMR分析，如圖2所示，根據(jù)文獻得出多孔淀粉分子中碳原子的對應信號[23]。OSA-PS的光譜圖與PS基本一致，表明酯化反應后骨架結構保持良好，圖2b中嵌入了OSA-PS部分放大的固態(tài)13C譜圖，范圍為120 ～250。該峰的中心位置為172，這是由13C的酯鍵化學位移引起的[24]，結果表明，通過酯化反應成功形成了OSA與PS之間的骨架連接。

圖2PS (a)和OSA改性PS (b)的13C CP/MAS NMR譜圖

2.2.3 傅里葉紅外光譜分析(FT-IR)

圖3多孔淀粉和OSA改性多孔淀粉的紅外光譜圖

2.2.4 X射線衍射分析(XRD)

多孔淀粉和OSA改性多孔淀粉的X射線衍射圖如圖4所示，Xc的相應值在表1中給出。所有淀粉樣品都顯示出典型的A型衍射峰，分別在15°、17°、18°和23°處有強的衍射峰。多孔淀粉和OSA改性多孔淀粉之間幾乎沒有差異，表明酯化反應不會改變淀粉的結晶類型。多孔淀粉的Xc值略高于OSA改性多孔淀粉的值，但不同OSA水平改性多孔淀粉之間的Xc值沒有顯著性差異(表1)。這表明OSA酯化主要發(fā)生在淀粉的無定形區(qū)域，與取代度較低的實際較為符合，該結果與He等[26]的研究一致。

圖4多孔淀粉和OSA改性多孔淀粉的X衍射圖譜

2.2.5 熱重分析(TGA-DTA)

OSA改性淀粉的熱特性TGA和DTG曲線如圖5所示。由圖5a可見，所有樣品的TGA曲線中觀察到兩個階段的質(zhì)量損失。第一階段發(fā)生在120 ℃以下，這是由水蒸發(fā)引起的質(zhì)量損失約8%。第二階段，即主要的質(zhì)量損失(約76%)，多孔淀粉發(fā)生在270 ℃，歸因于淀粉分解，而OSA改性多孔淀粉顯示出不同的模式，在較低溫度下開始(分別為253、250、229 ℃)[27]。此外，由圖5b可知，多孔淀粉，OSA改性多孔淀粉的最大熱分解溫度分別為325、321、316、311 ℃，且隨DS增加，最大熱分解溫度降低。結果表明，酯化過程降低了熱降解的初始溫度以及淀粉的熱穩(wěn)定性[28]。

圖5多孔淀粉和OSA改性多孔淀粉的TGA和DTG曲線

2.3 乳化穩(wěn)定性分析

從圖6可看出，靜置30 min后，多孔淀粉形成的乳液出現(xiàn)較明顯的分層現(xiàn)象，主要是由于多孔淀粉不溶于水且不具有乳化作用。OSA改性多孔淀粉中，1%OSA-PS由于所含OSA濃度小，乳化效果不明顯，而3%和5%的OSA-PS可以自由懸浮，形成穩(wěn)定的乳液，表明3%OSA-PS和5%OSA-PS具有良好的乳化性和乳化穩(wěn)定性。

圖6多孔淀粉和OSA改性多孔淀粉的乳化穩(wěn)定性比較

3 結論

淀粉的多孔結構會影響OSA改性淀粉的DS，隨著OSA濃度的增加，DS也隨之增加，并賦予OSA改性淀粉更大的乳化性和乳化穩(wěn)定性；OSA與淀粉之間形成酯鍵，但并不會破壞多孔淀粉孔結構和淀粉的晶型結構，改性主要發(fā)生在無定形區(qū)，OSA改性多孔淀粉后熱穩(wěn)定性降低。