王 雪，王子銘，李曉宇，馮 瑞，張貴學(xué)*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物遺傳育種與繁殖實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 大慶 163319；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 動(dòng)物繁殖實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

支持細(xì)胞（sertoli cells，SCs）是睪丸中唯一的體細(xì)胞，不僅是生精細(xì)胞的載體，為其供給所需營養(yǎng)物質(zhì)，還能合成與分泌多種免疫保護(hù)因子、生長因子和營養(yǎng)因子，對生精細(xì)胞起支持和營養(yǎng)作用［1-4］。SCs分泌的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、生長因子、調(diào)節(jié)蛋白、類固醇及其他一些活性物質(zhì)在精子發(fā)生過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用［5］。SCs還為精子流動(dòng)提供液體環(huán)境，參與下丘腦-垂體-睪丸軸的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，為生精細(xì)胞提供高濃度的雄激素環(huán)境并維持睪丸局部免疫豁免功能［6］。

關(guān)于牛SCs的分離和培養(yǎng)技術(shù)國內(nèi)外均有報(bào)道，主要存在分離步驟繁瑣、純度較低且摻有雜細(xì)胞、體外培養(yǎng)狀態(tài)不好等問題［7-10］。為進(jìn)一步深入研究睪丸SCs的各種功能和發(fā)生機(jī)制，建立一套穩(wěn)定的分離純化和原代培養(yǎng)體系是必要的。試驗(yàn)通過優(yōu)化現(xiàn)有的犢牛（新生7 d內(nèi)）睪丸SCs體外快速分離純化方法，以期建立一種簡單、快捷地獲得高純度SCs原代培養(yǎng)的方法及簡單易行、可靠的SCs鑒定方法。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

荷斯坦?fàn)倥＃ㄐ律? d內(nèi)）睪丸組織，由黑龍江省哈爾濱市雙城區(qū)鴻利血清生產(chǎn)公司屠宰現(xiàn)場提供。新生犢牛睪丸SCs還未成熟，該階段分離的SCs能夠響應(yīng)激素調(diào)節(jié)，而且增殖和分化能力較強(qiáng)。將閹割后完整的睪丸組織立即放入含1%青霉素-鏈霉素的PBS緩沖液中浸泡，然后冷藏或冰上冷凍，立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑

DMEM／F12培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS），購自美國Gibco公司；膠原酶Ⅳ和胰蛋白酶，購自美國Sigma公司；二甲基亞砜（DMSO）、TRIZol，購自Invitrogen公司；100×青鏈霉素（雙抗）混合液，購自中國Beyotime公司；Rever Tra Ace qPCR RT Master Mix去基因組試劑盒、PCR試劑盒，購自日本TOYOBO公司；DAPI，購自美國Roche公司。

DMEM／F12細(xì)胞培養(yǎng)基：含有10%FBS與1%雙抗，混合后于4℃保存；細(xì)胞凍存液：90%FBS與10%DMSO混合配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。

RT-PCR引物序列由中國庫美生物公司合成，引物信息見表1。

表1 RT-PCR各個(gè)基因引物序列、序列號和產(chǎn)物大小

1.3 主要儀器

自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，購自Invitrogen公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱，購自Bio-RAD公司；倒置熒光顯微鏡（型號為IX51），購自日本OLYMPUS公司；瓊脂糖凝膠電泳槽，購自北京六一公司；HT8500全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)。以上儀器均來源于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物繁殖實(shí)驗(yàn)室。

2 方法

2.1 SCs的分離與培養(yǎng)

2.1.1 分離與純化 采用兩步酶法和差速貼壁法分離純化SCs。使用鑷子將睪丸從PBS緩沖液里迅速取出并用含1%青鏈霉素的PBS沖洗，然后移入無菌皿中；在超凈臺內(nèi)剝?nèi)ネ饽ぜ安G丸縱膈，將曲細(xì)精管轉(zhuǎn)移至新皿中并剪碎成肉糜狀；把肉糜轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，將1.0 mg／mL膠原酶Ⅳ及50μg／mL DNase 5 mL于34℃水育搖床消化（110次／min）30 min；1 000 r／min離心5 min，倒掉上清液；用2.5 mg／mL胰蛋白酶、50μg／mL DNase于34℃水育搖床（110次／min）消化20 min；向混合物中加入與上一步胰蛋白酶等體積的DMEM培養(yǎng)液終止消化；倒入100μm無菌不銹鋼濾網(wǎng)中過濾；收集過濾液置于新離心管中，用DMEM培養(yǎng)液漂洗2次；1 200 r／min離心5 min后棄掉上清液；細(xì)胞沉淀重懸于含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM／F12培養(yǎng)液中；在37℃5% CO2條件下孵育培養(yǎng)1.0～1.5 h后將漂浮細(xì)胞懸液移至新培養(yǎng)皿中（以除去部分類肌細(xì)胞）。將漂浮懸液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用DMEM／F12培養(yǎng)基多漂洗幾次（以去除生精細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞），保留貼壁細(xì)胞（大多數(shù)SCs已經(jīng)貼壁）；重新加入DMEM／F12細(xì)胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

2.1.2 培養(yǎng)與傳代 細(xì)胞鋪滿整個(gè)皿（60 mm）即可傳代，用PBS輕輕洗一下，加入0.25%胰蛋白酶1 mL，37℃孵育3 min，呈單個(gè)細(xì)胞狀態(tài)則立即用培養(yǎng)液終止消化，離心后制成細(xì)胞懸液，以8×105／cm2的細(xì)胞密度進(jìn)行傳代，重新接種于60 mm培養(yǎng)皿中。

2.1.3 細(xì)胞凍存 按照FBS、DMSO之比9∶1的比例配制凍存液，現(xiàn)用現(xiàn)配。待細(xì)胞鋪滿整個(gè)培養(yǎng)皿后消化細(xì)胞，低速離心后用凍存液將細(xì)胞重懸，以1 mL的量分至每個(gè)凍存管中。先4 ℃放置30 min，然后-20℃放置1 h，再于-80℃放置過夜，最后放入液氮中長期保存。

2.1.4 細(xì)胞復(fù)蘇 從液氮中取出細(xì)胞，迅速放置于37℃水浴鍋中速溶；在超凈臺上將細(xì)胞反復(fù)吹打混勻，加入適量DMEM／F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基離心5 min（1 000 r／min），棄掉上清液；細(xì)胞用新的DMEM／F12培養(yǎng)液均勻鋪至培養(yǎng)皿中，于37℃5% CO2條件下孵育，次日觀察生長情況。

2.2 SCs形態(tài)學(xué)觀察與純度鑒定

在顯微鏡下觀察新分離培養(yǎng)的SCs形態(tài)和生長狀態(tài)。將新分離的SCs培養(yǎng)至第3代，制作細(xì)胞爬片后進(jìn)行HE染色。

應(yīng)用RT-PCR方法檢測SCs標(biāo)志基因的表達(dá)，再用免疫熒光方法檢測SCs標(biāo)志蛋白（WT1和Vimentin）的表達(dá)，并對SCs純度進(jìn)行鑒定。將新分離純化的SCs提取總RNA，再用RT-PCR方法檢測KRT-18、GDNF、SCF、WT1、Bmp4、FSHR、CYR61（肌細(xì)胞標(biāo)志基因）和CYP11A1（間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因）基因的表達(dá)。PCR反應(yīng)程序：94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，共35個(gè)循環(huán)。最后將PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳上分離。

將新分離的SCs和培養(yǎng)傳代的細(xì)胞制作細(xì)胞爬片，應(yīng)用SCs標(biāo)志蛋白WT1和Vimentin進(jìn)行免疫熒光染色。步驟：用含0.2% Triton X-100的4% 多聚甲醛（PFA）固定20 min；1%牛血清白蛋白（BSA）室溫封閉30 min；一抗4℃孵育過夜；FITC-熒光二抗（1∶300）室溫孵育2 h；DAPI核染2～10 min；鏡檢；封片和拍照。詳細(xì)方法參照參考文獻(xiàn)［2］，在顯微鏡下至少拍5個(gè)熒光視野。利用Image J軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)。細(xì)胞純度＝陽性染色細(xì)胞數(shù)／細(xì)胞總數(shù)×100%。

2.3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Image J軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 SCs的體外培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)觀察

3.1.1 倒置顯微鏡下觀察 新分離的原代SCs在倒置顯微鏡下略顯游離狀態(tài)，SCs體積較小，形態(tài)呈圓形顆粒狀，折光性強(qiáng)，見圖1A。體外培養(yǎng)1周后，顯微鏡下可見細(xì)胞形態(tài)呈不規(guī)則的梭型并向四周延伸。細(xì)胞生長狀態(tài)良好，見圖1B。細(xì)胞基本鋪成單層，相鄰細(xì)胞發(fā)生交錯(cuò)連接，細(xì)胞質(zhì)中可見較多的顆粒狀物質(zhì)或空泡，細(xì)胞折光性減弱，相鄰SCs緊密連接，細(xì)胞融合成片，鋪成膜狀單層。

3.1.2 HE染色 HE染色結(jié)果表明，睪丸SCs呈長梭狀或不規(guī)則的多邊形，有3～4個(gè)突起，胞質(zhì)完全鋪開，被染成紅色，有1個(gè)或多個(gè)圓形或橢圓形的細(xì)胞核，表明其增殖能力旺盛，見圖2。分離的細(xì)胞符合SCs的生物學(xué)特征。

3.2 SCs的活力與純度鑒定

對體外分離純化的原代SCs進(jìn)行4%臺盼藍(lán)染色，可見細(xì)胞存活率均在95%以上。為進(jìn)一步確定SCs分離純度，利用RT-PCR方法檢測SCs標(biāo)志基因，包括KRT-18、GDNF、SCF、WT1、Bmp4、FSHR，以及類肌細(xì)胞標(biāo)志基因CYR61和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因CYP11A1的表達(dá)情況。RT-PCR結(jié)果見圖3。結(jié)果均可見KRT-18、GDNF、SCF、WT1、Bmp4和FSHR基因目的條帶，但類肌細(xì)胞標(biāo)志基因CYR61也存在表達(dá)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志基因CYP11A1不表達(dá)。說明分離的SCs中仍存在一些類肌細(xì)胞，但不存在間質(zhì)細(xì)胞污染。因此，為了盡量除去類肌細(xì)胞，將新分離的睪丸雜細(xì)胞懸浮液培養(yǎng)1.0～1.5 h后，把漂浮懸液細(xì)胞移至新培養(yǎng)皿中，以達(dá)到除去一些類肌細(xì)胞的目的。

為進(jìn)一步鑒定新方法分離的SCs純度，選擇SCs特異性穩(wěn)定標(biāo)志蛋白WT1（sertoli cell marker，whole-stage）［4］和Vimentin（sertoli cell marker，whole-stage）［11］進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色。Vimentin是一種中間絲蛋白，與WT1一樣在SCs整個(gè)發(fā)育過程中連續(xù)表達(dá)，為SCs提供穩(wěn)定和可靠的蛋白標(biāo)記物，其熒光染色結(jié)果見圖3。WT1主要在原代SCs的細(xì)胞核中表達(dá)，WT1染色率為（98.7±0.5）%（n＝3）。Vimentin主要在SCs細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，形成細(xì)胞骨架的一部分，并且主要位于核周圍，在周圍留下清晰可見的細(xì)胞骨架，SCs呈現(xiàn)出不規(guī)則的細(xì)胞形態(tài)特征，見圖4。Vimentin蛋白染色率為（98.3±0.5）%（n＝3）。上述結(jié)果表明，分離培養(yǎng)后的SCs純度較高，可用于后續(xù)研究。

4 討論

SCs對維持雄性生殖系統(tǒng)正常功能具有重要作用，表達(dá)的多種細(xì)胞因子不但可以維持精原干細(xì)胞（spermatogonial stem cells，SSCs）的自我更新（增殖和維持），還具有誘導(dǎo)SSCs分化的作用［5］。SCs還具有吞噬和免疫保護(hù)作用，睪丸SCs形成緊密連接，并形成免疫微環(huán)境以隔離分化的生精細(xì)胞，或者保護(hù)移植的細(xì)胞或組織免受有害的免疫反應(yīng)［12］。源自中胚層的SCs可作為再生醫(yī)學(xué)的新型細(xì)胞來源，可轉(zhuǎn)化為多電位神經(jīng)干細(xì)胞［13］。這表明SCs在基于細(xì)胞的治療和組織工程中具有廣闊的應(yīng)用前景。

國內(nèi)外關(guān)于牛SCs分離和培養(yǎng)的報(bào)道很多，但也存在分離數(shù)量少、鑒定方法陳舊、純度不夠高、生長緩慢等一系列問題。本試驗(yàn)對犢牛睪丸SCs原代提取和培養(yǎng)方法進(jìn)行優(yōu)化，擬解決新分離SCs的純度和培養(yǎng)問題。本試驗(yàn)中，兩步酶消化法可以獲得數(shù)量較多的細(xì)胞，但如果消化時(shí)間和方法掌握不好，細(xì)胞活力會受很大影響，培養(yǎng)后會出現(xiàn)大量的死細(xì)胞。因此，細(xì)胞處理過程中應(yīng)避免酶消化過度，防止細(xì)胞損傷，如過濾過程中禁止攪拌。SCs培養(yǎng)最好選用干細(xì)胞培養(yǎng)級的血清。SCs喜歡密集的生長環(huán)境，每次傳代密度不可過低。本試驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)室提取的SCs在體外培養(yǎng)至10代左右增殖進(jìn)入平臺期；RT-PCR結(jié)果表明，分離出的未優(yōu)化的SCs存在類肌細(xì)胞污染。應(yīng)用兩步酶消化法獲取的新分離睪丸細(xì)胞主要包含SCs、生精細(xì)胞、類肌細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞。類肌細(xì)胞的貼壁能力強(qiáng)，在細(xì)胞接種1 h之內(nèi)就可直接貼壁在未被包被的光滑玻璃平面上，SCs一般在接種的4 h后貼壁，間質(zhì)細(xì)胞則在6 h后貼壁，而生精細(xì)胞則不易貼壁，長時(shí)間會處于游離懸浮狀態(tài)。因此，通過優(yōu)化的酶消化法和差速貼壁法可進(jìn)一步分離純化SCs。本試驗(yàn)通過1.0～1.5 h棄掉原來培養(yǎng)皿的辦法除去已貼壁的大部分類肌細(xì)胞，再用SCs標(biāo)志蛋白進(jìn)行熒光鑒定，免疫熒光結(jié)果顯示W(wǎng)T1和Vimentin的表達(dá)均在98%以上。通過優(yōu)化獲得的SCs方法簡單易行，細(xì)胞形態(tài)均勻，體外生長增殖活力旺盛，純度較高，可為進(jìn)一步研究提供素材，也可為其他動(dòng)物SCs的分離培養(yǎng)提供參考。

睪丸SCs具有多種生物學(xué)功能，越來越受到研究人員的重視，隨著培養(yǎng)技術(shù)的完善，關(guān)于其如何啟動(dòng)精子發(fā)生、如何維持SSCs的自我更新以及如何調(diào)節(jié)局部免疫活性的機(jī)制將逐漸被揭示。牛作為重要的家畜，提高種畜的繁育能力一直是養(yǎng)殖場管理者和技術(shù)人員關(guān)心的問題。因此，對SCs的研究也會逐漸引起關(guān)注。