鄧明田，王 鋒

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院／江蘇省家畜胚胎工程實(shí)驗(yàn)室，南京 210095）

哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育起始于精卵結(jié)合，受精卵經(jīng)歷重編程、母源-合子轉(zhuǎn)換（maternal-to-zygotic transition，MZT）和合子基因組激活（zygotic genome activation，ZGA），完成附植前發(fā)育。在胚胎發(fā)育起始階段胚胎基因組處于轉(zhuǎn)錄靜止?fàn)顟B(tài)，胚胎發(fā)育完全由母源mRNA和蛋白調(diào)控，但在1～3次快速卵裂后，母源mRNA和蛋白被逐漸清除，ZGA開始啟動(dòng)，參與調(diào)控早期胚胎發(fā)育［1］?；诟咄哭D(zhuǎn)錄組測(cè)序的研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物ZGA過程中約有35%的母源mRNA進(jìn)一步降解，12% ～24%的合子mRNA啟動(dòng)表達(dá)［2-4］；而利用RNA合成阻斷劑α-鵝膏菌素抑制ZGA發(fā)生，導(dǎo)致哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育阻滯［5］。因此，ZGA作為早期胚胎發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)折事件，其發(fā)生對(duì)早期胚胎發(fā)育和全能性的建立有著重要的意義。

研究發(fā)現(xiàn)，ZGA在不同物種中的發(fā)生時(shí)間和持續(xù)過程有著較大的差異。在小鼠胚胎中，ZGA由S／G2期次要的ZGA（minor ZGA）和2細(xì)胞期大規(guī)模的ZGA（major ZGA）組成［6］；大動(dòng)物ZGA一般出現(xiàn)在4到16細(xì)胞期［3，5］，表明ZGA受多種不同因素的調(diào)控，如DNA甲基化、組蛋白甲基化和非編碼RNA等表觀遺傳因素以及轉(zhuǎn)錄因子等。筆者就以上因素調(diào)控哺乳動(dòng)物ZGA的機(jī)制予以綜述。

1 哺乳動(dòng)物ZGA發(fā)生的表觀遺傳調(diào)控

表觀遺傳是指造成基因表達(dá)發(fā)生改變，但不在DNA內(nèi)進(jìn)行編碼的遺傳修飾，是染色質(zhì)調(diào)控的主要內(nèi)容。核小體是染色質(zhì)的基本單元，由H2A、H2B、H3和H4四個(gè)組蛋白組成八聚體，纏繞在長(zhǎng)度為146 bp的DNA上。DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA及N6-甲基腺嘌呤（N6-Methyladenosine，m6A）等表觀遺傳修飾均能影響染色質(zhì)重塑，調(diào)控ZGA過程。

1.1 DNA甲基化

DNA甲基化主要出現(xiàn)在胞嘧啶的第5位碳原子（5-methylcytosine，5-mC）上，由DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT3A（DNA methyltransferase 3A）和DNMT3B建立，并由Uhrf1（Ubiquitin-like PHD and RING finger domain-containing 1）、PCNA（Proliferating cell nuclear antigen）和DNMT1復(fù)合物維持。DNA甲基化還能被TET家族蛋白（Ten-eleven translocations）繼續(xù)氧化為5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5-hmC），實(shí)現(xiàn)DNA去甲基化［7］。

研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在早期胚胎發(fā)育過程中具有重要作用。例如敲除DNMT1引起X染色體失活（X chromosome inactivation，XCI）和胎盤發(fā)育異常［8］；敲除DNMT3A引起小鼠出生后死亡，敲除DNMT3B、Uhrf1和TET3均會(huì)導(dǎo)致小鼠胚胎致死［9-10］。小鼠胚胎發(fā)育過程中，父源基因組在minorZGA期經(jīng)歷迅速的去甲基化過程，而母源基因組和印記基因控制區(qū)域（imprinting control regions，ICRs）的5-mC水平基本維持不變，直至majorZGA過程中才逐漸去除（見圖1）。DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶及去甲基化酶的缺失引起印記基因ICR甲基化及父源基因組去甲基化異常，影響基因表達(dá)，最終導(dǎo)致胚胎死亡。由于5-hmC含量極低，在單堿基水平難以檢測(cè)，利用免疫熒光等方法發(fā)現(xiàn)在小鼠minor ZGA中，5-hmC在雄原核中逐漸升高［11］，可能也參與調(diào)控ZGA過程。

1.2 組蛋白甲基化

組蛋白甲基化是組蛋白主要的修飾形式之一，通常發(fā)生在H3和H4組蛋白的賴氨酸（K）殘基上，目前廣泛研究的賴氨酸甲基化位點(diǎn)包括組蛋白H3第4位（H3K4）、第9位（H3K9）、第27位（H3K27）、第36位（H3K36）和第79位（H3K79）及組蛋白H4第20位（H4K20），其中H3K4me3和H3K9me3調(diào)控ZGA發(fā)生的機(jī)制較為明確。

H3K4me3是轉(zhuǎn)錄激活的標(biāo)志，由MLL（Mixedlineageleukemia）和WDR5等建立，并經(jīng)KDM5（Lysine-specific demethylase 5）家族蛋白特異性去除，敲低WDR5和KDM5B均影響胚胎發(fā)育［12-13］。免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，H3K4me3在小鼠ZGA過程中逐漸降低，在majorZGA時(shí)期達(dá)到最低水平［14］；在豬和山羊胚胎ZGA過程中也處于最低水平［13，15］。利用超低量染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）技術(shù)，研究人員發(fā)現(xiàn)基因組上H3K4me3寬度與ZGA有關(guān)。在體細(xì)胞中，基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（transcriptional start sites，TSSs）附近普遍存在長(zhǎng)度約為1 000 bp的H3K4me3峰。在小鼠卵母細(xì)胞中，存在第二種H3K4me3峰，長(zhǎng)度可達(dá)100 kb，主要出現(xiàn)在TSS附近；大約22%的基因組存在這種寬H3K4me3修飾區(qū)域，可以保護(hù)基因組不被5-mC覆蓋。在ZGA發(fā)生時(shí)，存在第三種H3K4me3峰，長(zhǎng)度可達(dá)20 kb，主要出現(xiàn)在啟動(dòng)子和基因間區(qū)域，激活合子基因表達(dá)。ZGA的發(fā)生時(shí)，在KDM5A和KDM5B作用下第二種H3K4me3峰轉(zhuǎn)變?yōu)榈谌NH3K4me3峰（見圖2）。干擾KDM5A和KDM5B引起H3K4me3峰轉(zhuǎn)變異常，導(dǎo)致小鼠胚胎發(fā)育阻滯［14，16-17］。因此，H3K4me3通過改變修飾類型，參與調(diào)控小鼠胚胎ZGA發(fā)生。

H3K9me2／3與HP1（Heterochromatin protein 1）作用促進(jìn)染色質(zhì)壓縮和異染色質(zhì)形成，抑制基因表達(dá)。哺乳動(dòng)物ZGA過程中，H3K9me3被逐漸移除［3，15，18］。高紹榮課題組利用超低量ChIP-seq技術(shù)繪制了小鼠早期胚胎發(fā)育過程中H3K9me3動(dòng)態(tài)變化圖譜。小鼠早期胚胎發(fā)育過程中，H3K9me3標(biāo)記區(qū)域逐漸由卵母細(xì)胞特異性區(qū)域向卵裂特異性基因和囊胚特異性區(qū)域過渡。同時(shí)逆轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)錄活化，其LTR區(qū)域DNA甲基化逐漸移除，H3K9me3逐步建立。CHAF1A作為核心因子，調(diào)控逆轉(zhuǎn)錄因子LTR區(qū)域H3K9me3修飾，干擾CHAF1A引起調(diào)控逆轉(zhuǎn)錄因子LTR區(qū)域H3K9me3水平降低，促進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，導(dǎo)致小鼠胚胎發(fā)育阻滯［19］。另外研究發(fā)現(xiàn)，干擾TRIM28引起逆轉(zhuǎn)座子H3K9me3和DNA甲基化水平降低，激活基因表達(dá)，導(dǎo)致小鼠胚胎發(fā)育阻滯在ZGA時(shí)期［20］，表明H3K9me3主要通過影響逆轉(zhuǎn)座子表達(dá)調(diào)控小鼠ZGA發(fā)生。

1.3 非編碼RNA

MicroRNA（miRNA）是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22 nt的非編碼單鏈RNA分子，可通過靶向母源因子，參與調(diào)控早期胚胎發(fā)育［21］。例如，miR-125能抑制母源特異性表達(dá)基因SEBOX和LIN28A蛋白的表達(dá)，過表達(dá)miR-125導(dǎo)致小鼠胚胎發(fā)育阻滯在2細(xì)胞時(shí)期，干擾miR-125促進(jìn)ZGA發(fā)生［22］。最近Yang F.等［23］發(fā)現(xiàn)miR-344靶向Zmym2／Lsd1參與調(diào)控小鼠早期胚胎發(fā)育，表明miRNA在ZGA發(fā)生中的重要作用；且miRNA位置上呈現(xiàn)出高度的保守性，序列上呈現(xiàn)出高度的同源性，研究miRNA調(diào)控ZGA發(fā)生的機(jī)制具有重要的參考價(jià)值。

與mRNA類似，lncRNA也在ZGA過程中發(fā)生母源降解和合子lncRNA轉(zhuǎn)錄［24-25］。近期研究發(fā)現(xiàn)，敲低lncRNA il17d引起il17d基因啟動(dòng)子甲基化水平升高，il17d基因表達(dá)水平降低，影響多能性基因Oct3／4、Klf4和c-Myc表達(dá)水平，同時(shí)胚胎凋亡水平升高，增殖能力降低，最終影響胚胎發(fā)育［26］。LncRNA LincGET可與hnRNPU、FUBP1和ILF2形成RNA-蛋白復(fù)合物，干擾lincGET促進(jìn)GLN、內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄因子MERVL和ERVK的長(zhǎng)末端重復(fù)序列的順勢(shì)調(diào)控活性，抑制RNA可變剪切，導(dǎo)致小鼠胚胎2細(xì)胞阻滯［27］。LincGET還能與CARM1形成復(fù)合體，建立激活型染色質(zhì)修飾H3R26me2，增加全基因組染色質(zhì)的開放程度，提高多能性基因表達(dá)水平，從而在ZGA過程中決定卵裂球命運(yùn)［28］。因此，lncRNA是調(diào)控ZGA發(fā)生的重要因素之一，但lncRNA數(shù)量眾多，功能復(fù)雜，仍需繼續(xù)挖掘研究參與調(diào)控ZGA的lncRNA。

1.4 N6-甲基腺嘌呤

m6A是真核細(xì)胞RNA中最為豐富的一種內(nèi)在修飾，參與調(diào)控基因表達(dá)。mRNA前體在METTL3（Methyltransferase Like 3）、METTL14和WTAP（WT1 Associated Protein）組成的甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體作用下發(fā)生甲基化，并在去甲基化酶FTO（Fat Mass and Obesity-Associated Protein）和ALKBH5（AlkB Homolog 5）的作用下去甲基化。發(fā)生m6A修飾的RNA可被多個(gè)m6A結(jié)合蛋白識(shí)別并發(fā)揮不同的作用。其中，YTHDF2可在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)識(shí)別3′-UTR 發(fā)生的m6A 修飾并與之結(jié)合形成YTHDF2-m6A復(fù)合物，介導(dǎo)RNA翻譯或穩(wěn)定性［29］。在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中，敲除YTHDF2導(dǎo)致發(fā)生m6A修飾的母源mRNA半衰期延長(zhǎng)，合子基因表達(dá)受阻，影響ZGA發(fā)生，導(dǎo)致胚胎發(fā)育遲緩［30］，表明m6A修飾也參與調(diào)控胚胎ZGA發(fā)生，但m6A影響母源和合子基因穩(wěn)定性的機(jī)制仍不清楚［31］。

2 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控ZGA發(fā)生的機(jī)制

雖然在MZT過程中，大部分母源RNA發(fā)生降解，但是約有10%的母源物質(zhì)被保留下來，參與調(diào)控ZGA發(fā)生，如敲除YAP的小鼠胚胎中80%的母源基因不能降解，同時(shí)近700個(gè)合子基因未能激活表達(dá)，導(dǎo)致胚胎阻滯在2細(xì)胞［32］；敲除BTG4的胚胎不能招募CNOT7脫腺苷酸酶促進(jìn)母源物質(zhì)降解，出現(xiàn)2細(xì)胞阻滯現(xiàn)象［33］，表明母源因子能作為轉(zhuǎn)錄因子影響ZGA的發(fā)生，也能指導(dǎo)母源mRNA的清除。

轉(zhuǎn)錄因子還能調(diào)節(jié)染色質(zhì)可塑性，影響表觀遺傳修飾，如組蛋白去甲基化酶LSD1在GV期卵母細(xì)胞和合子中均有極高的表達(dá)量，敲除LSD1導(dǎo)致小鼠胚胎2細(xì)胞阻滯，且出現(xiàn)重編程異常的現(xiàn)象［34］。STELLA也稱為DPPA3（Developmental pluripotency associated 3）或PGC7，能和Uhrf1形成復(fù)合體。在卵母細(xì)胞的發(fā)育中STELLA高水平表達(dá)，通過主動(dòng)出核轉(zhuǎn)運(yùn)過程，防止Uhrf1在卵母細(xì)胞核內(nèi)累積和DNA甲基化異常升高，調(diào)控卵母細(xì)胞成熟。研究發(fā)現(xiàn)，敲除STELLA的小鼠胚胎出現(xiàn)2細(xì)胞阻滯。一方面，Stella缺失導(dǎo)致沉默的基因組區(qū)域發(fā)生異常高甲基化，嚴(yán)重影響成熟卵子的質(zhì)量和受ZGA過程中的母源基因組激活［35］；其次敲除STELLA引起逆轉(zhuǎn)錄因子激活失敗，影響合子基因表達(dá)［36］；另外STELLA還能與印記基因H3K9me2結(jié)合，防止其ICR發(fā)生去甲基化［37］，表明轉(zhuǎn)錄因子能從表觀遺傳修飾等多個(gè)層面調(diào)控ZGA發(fā)生，是ZGA的重要調(diào)控因素。

3 展望

綜上所述，ZGA作為早期胚胎發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)折事件，其發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜且高度協(xié)調(diào)的過程，受DNA甲基化、組蛋白甲基化和非編碼RNA等表觀遺傳修飾和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，構(gòu)成了一個(gè)精細(xì)的多層次調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。由于ZGA過程中大量的mRNA和非編碼RNA差異表達(dá)，挖掘其他驅(qū)動(dòng)ZGA發(fā)生的因子仍是相關(guān)研究的重點(diǎn)；另外，ZGA過程中表觀調(diào)控因子之間的相互作用也有待進(jìn)一步探究。