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        雙抗可促進子宮頸細胞天然防御反應
        ——DEFA1和DEFB1

        2020-07-07 10:40:56Adegoke黃富碩馬銘鈞張貴學
        黑龍江動物繁殖 2020年1期

        王 皓,鄭 鵬,王 雪,Adegoke E O,黃富碩,馬銘鈞,張貴學

        (東北農業(yè)大學 動物科技學院,哈爾濱 150030)

        防御素(Defensins)是一類不含糖鏈的堿性陽離子多肽,廣泛分布于動植物界,富含6個半胱氨酸結構和3對分子內二硫鍵[1-5]。防御素具有多方面的免疫功能,對細菌、病毒和部分寄生蟲都有滅殺作用,不但是先天性免疫組成部分還參與適應性免疫[6]。人類表達α-防御素和β-防御素[7]。現已發(fā)現人類α-防御素6種;β-防御素31種[8],其中6種(HBD1-6)已經被證明[9-11]。人類防御素主要表達于與外界相接觸或相通的各種黏膜細胞,例如呼吸道、胃腸道、泌尿道、生殖道以及皮膚等[10]。研究表明,防御素水平經常在感染炎癥或組織損傷的反應中發(fā)生改變[3,12],表明防御素在免疫調節(jié)作用中發(fā)揮作用。

        雙抗具有殺菌作用,可以直接添加到細胞培養(yǎng)液內,具有抑制細菌生長、避免細胞污染的作用。同時抗生素也是一種細胞毒素,其是否會直接作用于有機體組織細胞,導致天然防御應答鮮見報道。故本試驗意在通過青霉素和鏈霉素兩種抗生素處理Hela細胞,探究抗生素對子宮頸上皮細胞DEFA1和DEFB1表達的影響,為抗生素刺激細胞的天然防御提供理論和實踐依據。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        Hela細胞株,ATCC編號CCL-2;DMEM高糖培養(yǎng)基,美國Gibco公司產品;胎牛血清(FBS),美國ScienCell公司產品;PBS和胰蛋白酶,均為Solarbo公司產品;DMSO,購自美國Sigma公司;青霉素鈉和硫酸鏈霉素,購自碧云天生物技術公司;孕烯二酮(孕酮)和17-β雌二醇,購自Sigma公司;Trizol,美國Ambion公司產品;反轉錄試劑盒,加拿大Abm公司產品;PCR試劑盒,TakaRa公司產品;電泳所用TAE,納川生物技術公司產品;瓊脂糖為Biowest公司產品;引物,由吉林庫美生物科技公司合成;熒光定量試劑盒FastStart Universal SYBR Green Master(ROX),Roche公司產品;RIPA裂解液,Thermo Fisher公司產品;SDS-PAGE電泳液,Solarbo 公 司 產 品;1.5 mol/L Tris- HCl(pH=8.8),Solarbo公司產品;配制TBST所用1.0 mol/L Tris-HCl(pH=8.0),Solarbo公司產品;1.0 mol/L Tris-HCl(pH=6.8),Solarbo公司產品;四甲基乙二胺(TEMED),Biosharp公司產品;抗體,購自Proteintech公司;ECL發(fā)光試劑盒,南京諾維贊生物科技有限公司產品;膜再生液,購自Solarbo公司。

        1.2 雙抗母液配制

        按照青霉素(P)10 kU/mL+鏈霉素(S)10 mg/mL配制青霉素-鏈霉素混合溶液(PS),用0.22μm濾器過濾除菌,將配好的雙抗母液分裝至小瓶后-20℃保存,備用。后面試驗中1%雙抗即為100 U/mL青霉素+0.1 mg/mL鏈霉素的青鏈霉素混合液,5%雙抗同理。

        1.3 細胞培養(yǎng)

        采用含有10%血清、1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中恒溫恒濕培養(yǎng)Hela細胞。細胞生長至80% ~90%匯合度時,用0.25%胰蛋白酶消化傳代繼續(xù)培養(yǎng),以供后續(xù)試驗使用。

        1.4 細胞處理

        1.4.1 不同濃度的雙抗培養(yǎng)Hela細胞 將生長狀況良好的Hela細胞按照1×106個/孔接種到六孔板中,待Hela細胞貼壁后分別用含無雙抗、1%雙抗和5%雙抗的培養(yǎng)液(FBS濃度為10%)培養(yǎng)處理Hela細胞。48 h后,用熒光定量PCR檢測DEFA1和DEFB1的表達。

        用Western Bolt測定DEFA1蛋白的表達情況。收集細胞加入RIPA裂解液裂解細胞,離心,提取蛋白上清液,加入loading buffer,100℃煮樣5 min,上樣,電泳,分離,轉膜至含50 g/L脫脂奶粉的TBST,室溫封閉濾膜1 h,一抗β-actin(1∶4 000),DEFA1(1∶150)4℃孵育過夜。在搖擺式搖床上用TBST清洗PVDF膜3次后,室溫孵育二抗2 h(1∶3 000),TBST清洗膜3次,ECL化學發(fā)光法顯影成像,使用Image J對蛋白條帶進行灰度分析。

        1.4.2 無雙抗培養(yǎng)Hela細胞后不同時間DEFA1和DEFB1表達的影響 由于Hela細胞長期在雙抗培養(yǎng)和保存環(huán)境中,故從相反的角度確定雙抗對DEFA1和DEFB1表達的影響。將生長狀況良好的Hela細胞按照1×106個/孔接種到六孔板中,待Hela細胞貼壁后用不含雙抗的培養(yǎng)液培養(yǎng)。分別在24 h、48 h、72 h后收細胞。用熒光定量PCR檢測DEFA1和DEFB1的表達,Western Bolt測定DEFA1蛋白的表達情況,方法同1.4.1。

        1.4.3 雙抗對Hela細胞DEFA1和DEFB1表達的影響 將生長狀況良好的Hela細胞按照1×106個/孔接種到六孔板中,待Hela細胞貼壁后分別用含無雙抗、1%青霉素、1%鏈霉素的培養(yǎng)液分別培養(yǎng)。48 h后收細胞,用熒光定量PCR檢測DEFA1和DEFB1的表達,Western Bolt測定DEFA1蛋白的表達情況,方法同1.4.1。

        1.5 引物設計

        根據GeneBank中人β-actin基因(登錄號為X00351.1)防御素alpha1(DEFA1)和防御素beta1(DEFB1,登錄號為NM_004084.3,NM_005218.3),用Primer 5.0軟件分別設計特異性引物。其中β-actin為內參基因,引物序列見表1。引物由吉林庫美生物科技有限公司合成。

        表1 引物序列

        1.6 統(tǒng)計分析

        ΔCt=目的基因的Ct值-內參基因的Ct值。

        ΔΔCt=(試驗組目的基因Ct值-試驗組內參基因Ct值)-(對照組目的基因Ct值-對照組內參基因Ct值)。

        目的基因相對表達量=2-ΔΔCt。

        2 結果

        2.1 Hela細胞鏡下觀察

        無雙抗培養(yǎng)24,48,72 h后,用倒置顯微鏡放大100倍后觀察結果見圖1。

        2.2 雙抗對Hela細胞防御素的影響

        2.2.1 雙抗對DEFA1的影響 見圖2、圖3。QPCR結果表明,1%、5%雙抗處理組與對照組相比,Hela細胞的DEFA1表達差異顯著(P<0.05)。Western結果表明,與定量檢測結果相符合。

        2.2.2 雙抗對DEFB1的影響 見圖4。從qPCR結果可以看出,隨著青霉素、鏈霉素混合液濃度的增加,DEFB1基因表達量逐漸升高,濃度為5%時DEFB1表達量最高,三組之間均差異顯著(P<0.05)。說明微生物毒素對防御素的表達有促進作用。

        2.3 無雙抗培養(yǎng)Hela細胞不同時間Hela細胞防御素的變化

        2.3.1 無雙抗培養(yǎng)不同時間對DEFA1的影響 見圖5、圖6。qPCR結果表明,無雙抗培養(yǎng)細胞時隨著培養(yǎng)時間的延長,DEFA1基因表達量逐漸降低,在培養(yǎng)24 h、48 h和72 h之間差異顯著(P<0.05)。

        蛋白結果表明,無雙抗培養(yǎng)細胞時到72 h時,DEFA1的蛋白表達量基本不變,與定量結果不一致。

        2.3.2 無雙抗培養(yǎng)不同時間對DEFB1的影響 見圖7。qPCR結果表明,無雙抗培養(yǎng)細胞時,DEFB1基因表達量在培養(yǎng)24 h和48 h時無差異,72 h和前兩組差異顯著(P<0.05)。

        2.4 單獨加入青霉素和鏈霉素培養(yǎng)Hela細胞

        2.4.1 青霉素和鏈霉素對DEFA1的影響 見圖8、圖9。qPCR結果顯示,使用1%青霉素和1%鏈霉素分別處理Hela細胞,DEFA1基因表達量均顯著高于對照組(P<0.05),1%青霉素處理組的DEFA1表達量高于1%鏈霉素處理組。蛋白表達結果表明,1%青霉素處理組和1%鏈霉素處理組DEFA1蛋白表達量均高于對照組。

        2.4.2 青霉素和鏈霉素對DEFB1的影響 見圖10。qPCR結果顯示,1%青霉素和鏈霉素處理組的DEFB1基因表達顯著均高于對照組(P<0.05)。說明青霉素和鏈霉素均能促進防御素DEFB1的表達。

        3 討論

        青霉素是一種真菌毒素,蘇格蘭科學家亞歷山大弗萊明在1928年發(fā)現了青霉素[13],1942年被人們利用來治療感染[14]。鏈霉素是1943年被賽爾曼在灰色鏈霉菌的提取物中發(fā)現的一種細菌毒素[15],對某些微生物,如結核桿菌有特效,是繼青霉素之后第二個被大量生產并廣泛應用的抗生素。

        3.1 青霉素和鏈霉素單獨處理對防御素的影響

        從圖8~10的結果可知,青霉素和鏈霉素均能促進兩種防御素(DEFA1和DEFB1)的表達,在青霉素或鏈霉素的作用下先天性免疫機制被觸發(fā)[6],產生防御素,防御素作為生殖道的第一道天然防御屏障發(fā)揮多種作用[6]。

        3.2 雙抗對防御素的影響

        圖2~4的結果表明,隨著雙抗?jié)舛鹊脑黾?,DEFA1和DEFB1表達量均顯著升高。由此可見,作為微生物的毒素可以激發(fā)天然防御機能。面對外源病菌刺激時,子宮頸上皮細胞通過產生防御素[6]防御外源刺激,且隨著刺激強度的增加子宮頸上皮細胞防御素的分泌也會增加。

        3.3 無雙抗培養(yǎng)不同時間Hela細胞防御素的變化

        圖5、圖7的結果表明,隨著抗生素刺激的消失,在mRNA水平DEFA1和DEFB1表達量下降,即轉錄停止,而圖6的蛋白結果顯示,在抗生素刺激消失的72 h內DEFA1蛋白水平表達量不變,即翻譯還在繼續(xù)。這表明在抗生素刺激消失一段時間之內,子宮頸上皮細胞防御素不會立即消失,仍然有防御能力。細胞培養(yǎng)時加入的雙抗為青霉素和鏈霉素按照一定比例的混合液。綜合以上結果,細胞培養(yǎng)中加入雙抗防止污染,雙抗的作用除了青霉素和鏈霉素二種抗生素本身的直接殺菌作用外,還能刺激細胞產生防御素。

        4 結論

        青霉素和鏈霉素除了有直接殺菌作用外,雙抗可促進子宮頸細胞天然防御反應,刺激細胞產生防御素間接殺菌。

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