郭茹，孫世海，葉霞，華仁銳

（天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院，天津300384）

藍(lán)莓，又稱(chēng)越桔或藍(lán)漿果，屬于杜鵑花科（Ericaceae）越桔屬（Vaccinium）植物，多年生落葉或常綠灌木。全世界約400 個(gè)種，廣泛分布于北半球，以北美資源最為豐富。中國(guó)藍(lán)莓栽培起步較晚，自20 世紀(jì)80 年代初，有關(guān)單位先后從國(guó)外引進(jìn)100 多個(gè)藍(lán)莓品種，并進(jìn)行了栽培和育苗研究[1]。藍(lán)莓果中含有花色素苷、黃酮等多種多酚類(lèi)生理活性物成分，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織將藍(lán)莓列為人類(lèi)五大健康食品之一，同時(shí)被認(rèn)為是21 世紀(jì)最有發(fā)展前途的新型高檔果樹(shù)樹(shù)種[2-3]。藍(lán)莓的常規(guī)繁殖方法較多，有種子育苗、綠枝扦插、硬枝扦插、根插和分株嫁接等，但繁殖系數(shù)低，生長(zhǎng)速度慢，品種易退化[4-6]。利用組織培養(yǎng)的方法可以在短期內(nèi)大大提高繁殖系數(shù)，縮短繁殖時(shí)間，并且可以保持品種的優(yōu)良特性，現(xiàn)己成為近年來(lái)眾多學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一[7-10]。多數(shù)研究者認(rèn)為，玉米素（ZT）是促進(jìn)越橘屬植物離體快繁的最佳外源調(diào)節(jié)劑，比如蔓越橘、矮叢藍(lán)莓、越橘加入ZT 后其離體繁育的增殖效果明顯[11-12]。關(guān)于不同類(lèi)型的支撐物在組培中的應(yīng)用效果研究鮮少報(bào)道，國(guó)內(nèi)有柴慈江[13-15]研究，以土壤作為支撐物，進(jìn)行葡萄、珠美海棠以及栒子的生根培養(yǎng)。為了進(jìn)一步研究提高生產(chǎn)效率，并降低生產(chǎn)成本，該試驗(yàn)通過(guò)探索不同支撐物、不同營(yíng)養(yǎng)液濃度以及ZT 濃度對(duì)藍(lán)莓試管苗靜置培養(yǎng)增殖的影響，從而獲得適合藍(lán)莓試管苗增殖生長(zhǎng)的最適培養(yǎng)條件，推動(dòng)試管苗的大規(guī)模生產(chǎn)。

斯巴坦（Spartan）作為北高叢藍(lán)莓的一種早熟品種，1978 年由美國(guó)農(nóng)業(yè)部選育，由‘Earlyblue’בUS11-93’雜交育成。早產(chǎn)豐產(chǎn)、品質(zhì)優(yōu)良，極具栽培潛力。該研究以斯巴坦試管苗的莖段為外植體，對(duì)斯巴坦在不同增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)后的芽數(shù)、芽高、增殖系數(shù)、年繁殖數(shù)進(jìn)行測(cè)定計(jì)算，觀察藍(lán)莓斯巴坦不同培養(yǎng)的生長(zhǎng)特性，篩選出藍(lán)莓斯巴坦的最佳增殖培養(yǎng)基，為藍(lán)莓斯巴坦進(jìn)一步大規(guī)模生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試品種取自天津農(nóng)學(xué)院園藝植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室盆栽的藍(lán)莓斯巴坦品種，取外植體進(jìn)行初代培養(yǎng)，并且連續(xù)繼代培養(yǎng)3 次后，保證組培苗的健壯。取組培苗高3.0±0.5 cm 且長(zhǎng)勢(shì)一致的藍(lán)莓斯巴坦繼代組培苗為增殖的接種材料。蛭石、珍珠巖均購(gòu)自朝日物產(chǎn)（天津）園藝科技股份有限公司，其中珍珠巖用自來(lái)水淘洗3 遍后烘干備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 初代培養(yǎng)。供試藍(lán)莓品種為斯巴坦，在春季藍(lán)莓新枝生長(zhǎng)旺盛時(shí)期的晴天上午選取當(dāng)年生健壯的半木質(zhì)化嫩枝，去除葉片，在流水下沖洗3～5 min，剪去頂端最嫩莖節(jié)。置超凈工作臺(tái)上，將其剪成2 cm 左右的帶單芽的莖段，用75%的酒精消毒15 s 后，無(wú)菌水蕩洗3 次，再用0.1%升汞溶液消毒7 min，無(wú)菌水蕩洗5 次，每次30 s，備用。

1.2.2 增殖培養(yǎng)。將組培苗接入到不同的培養(yǎng)基中，即3因素3 水平正交試驗(yàn)[L9（33）]設(shè)計(jì)的誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)基見(jiàn)表1。藍(lán)莓斯巴坦增殖培養(yǎng)基成分見(jiàn)表2。試驗(yàn)設(shè)9 個(gè)處理，每個(gè)處理接種20 瓶，每瓶接入3 株，共計(jì)60 株。培養(yǎng)基pH 5.2±0.1。培養(yǎng)40 d 后統(tǒng)計(jì)植株長(zhǎng)勢(shì)、株高、增殖系數(shù)、年繁殖數(shù)。

表1 L9（33）因素及水平

表2 增殖培養(yǎng)基成分

計(jì)算公式：增殖系數(shù)=培養(yǎng)后總芽數(shù)/接種時(shí)總芽數(shù)×100%；

年繁殖數(shù)=m·Xn

其中，m：無(wú)菌母株苗數(shù)；X：平均每個(gè)培養(yǎng)周期的增殖系數(shù)；n：每年可增殖的周期次數(shù)。

使用100 mL 廣口的培養(yǎng)瓶，以瓊脂為支撐物的培養(yǎng)基分別添加蔗糖20 g/L、瓊脂8 g/L；以蛭石、珍珠巖為支撐物的培養(yǎng)基，蛭石、珍珠巖的用量每瓶均為8 g，再加入營(yíng)養(yǎng)液40 mL，各處理支撐物及相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)液分裝后，置于高壓蒸汽滅菌鍋中121℃下滅菌20 min。

1.2.3 培養(yǎng)條件。將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)室內(nèi)，培養(yǎng)溫度為23±2℃，光照強(qiáng)度為2000 lx，光照時(shí)間為12 h。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 完成對(duì)數(shù)據(jù)的基本處理，采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理藍(lán)莓試管苗增殖的生長(zhǎng)狀況

選取生長(zhǎng)健壯且大小一致的藍(lán)莓試管苗接種于增殖培養(yǎng)基上，接種15 d 后觀察生長(zhǎng)狀況，40 d 調(diào)查芽數(shù)、芽高及芽生長(zhǎng)勢(shì)，并計(jì)算增殖系數(shù)和年繁殖數(shù)（40 d 為1 個(gè)周期，1 年繁殖9 次），不同處理結(jié)果詳見(jiàn)表3。

表3 不同處理藍(lán)莓組培苗增殖情況

在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓斯巴坦的增殖隨著不同的處理表現(xiàn)出不同的差異。接種15 d 后，處理4 和處理5 大部分在節(jié)間處形成芽，且處理4 的葉片大而綠，芽粗壯。處理1 和處理2 只有少部分在節(jié)間處形成芽，芽小且葉片呈淡綠色。接種40 d 后，對(duì)其增殖系數(shù)、平均芽高和年增殖數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，調(diào)查藍(lán)莓斯巴坦組培苗在9 個(gè)不同處理中的增殖情況。由表3 可知，處理4 增殖系數(shù)最高，為5.14，采用這一技術(shù)，理論上1 株試管苗1 年可以生產(chǎn)藍(lán)莓組培苗約為2505733.52 株，明顯超過(guò)其他處理。結(jié)合藍(lán)莓幼苗的生長(zhǎng)狀況，較優(yōu)的處理是處理1、處理2、處理4 和處理5。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，分別對(duì)各處理的增殖系數(shù)和平均芽高進(jìn)行極差分析（表4）。

2.2 不同因素對(duì)藍(lán)莓試管苗增殖影響的極差分析

不同因素對(duì)藍(lán)莓叢生芽增殖影響的極差分析如表4所示。根據(jù)各因素的極差值來(lái)分析其對(duì)藍(lán)莓斯巴坦組培苗增殖的影響程度，R 值越大說(shuō)明影響越顯著。

由表4 可知，各因素對(duì)藍(lán)莓斯巴坦試管苗增殖情況的影響大小不同，且影響的規(guī)律也不相同。支撐物、營(yíng)養(yǎng)液、ZT 濃度3 個(gè)因素對(duì)增殖系數(shù)的影響大小順序?yàn)橹挝铮綵T 濃度＞營(yíng)養(yǎng)液濃度，支撐物對(duì)藍(lán)莓斯巴坦增殖效果的影響最大，而營(yíng)養(yǎng)液濃度的影響最??；對(duì)平均芽高影響大小順序?yàn)橹挝铮緺I(yíng)養(yǎng)液濃度＞ZT 濃度，支撐物對(duì)藍(lán)莓斯巴坦增殖效果的影響最大，而ZT 濃度的影響最小。

表4 不同因素對(duì)藍(lán)莓試管苗增殖影響的極差分析

2.3 不同因素對(duì)藍(lán)莓試管苗增殖影響的方差分析

不同因素對(duì)藍(lán)莓斯巴坦叢生芽增殖的影響方差分析如表5 所示。由表5 可知，支撐物、培養(yǎng)物和ZT 濃度3 個(gè)因素對(duì)增殖系數(shù)和平均芽高的影響均達(dá)到了顯著差異。因此需要對(duì)支撐物、培養(yǎng)物和ZT 濃度各水平作進(jìn)一步的多重比較分析。

表5 不同因素對(duì)藍(lán)莓試管苗增殖的影響方差分析

2.4 不同因素對(duì)藍(lán)莓試管苗增殖影響的多重比較

支撐物、培養(yǎng)基、ZT 濃度各水平增殖系數(shù)差異顯著。因而還需進(jìn)行支撐物、培養(yǎng)基、ZT 濃度各水平增殖系數(shù)的多重比較。詳見(jiàn)表6～8。

由表6 可知，支撐物為珍珠巖處理的平均增殖系數(shù)最高達(dá)到3.5421，支撐物為瓊脂和支撐物為蛭石處理的差異不顯著，二者均與支撐物為珍珠巖處理差異顯著，其中，支撐物為蛭石處理的增殖系數(shù)最低，為1.5491；珍珠巖處理的平均芽高最大，為3.2600 cm，3 種不同支撐物處理的間的平均芽高均達(dá)到極顯著水平。

表6 支撐物各水平LSD 檢驗(yàn)

由表7 可知，營(yíng)養(yǎng)液WPM 處理的平均增殖系數(shù)最高，達(dá)到3.1716，其中WPM 處理與1/4WPM 處理差異極顯著，二者均與1/2WPM 處理差異顯著；WPM 處理的平均芽高最大，為2.7744 cm，與1/2WPM 處理的差異達(dá)顯著水平，與1/4WPM 處理的差異達(dá)到極顯著水平，1/2WPM 處理和1/4WPM 處理的差異也達(dá)到極顯著水平，1/4WPM 處理的平均芽高最低，為1.2267 cm。

表7 營(yíng)養(yǎng)液濃度各水平LSD 檢驗(yàn)

由表8 可知，1 mg/L ZT 處理的平均增殖系數(shù)和平均芽高均最大，分別為3.3194 和2.5489 cm，0.5 mg/L ZT處理與1.2 mg/L ZT 處理差異不顯著，二者均與1 mg/L ZT 處理差異顯著。綜合正交試驗(yàn)和方差分析結(jié)果得知，營(yíng)養(yǎng)液靜置培養(yǎng)增殖的最優(yōu)水平可設(shè)定為珍珠巖+WPM+1mg/LZT。

表8 ZT 濃度各水平LSD 檢驗(yàn)

3 結(jié)論與討論

目前，部分藍(lán)莓的組培快繁體系已經(jīng)在MS、WPM、改良WPM 等基本培養(yǎng)基上成功建立。藍(lán)莓在WPM 培養(yǎng)基上有較高的增殖系數(shù)和株高。所以，該試驗(yàn)研究不同倍數(shù)WPM 作為營(yíng)養(yǎng)液的增殖效果。傳統(tǒng)組培用蔗糖作為支撐物起到固定作用，進(jìn)行增殖培養(yǎng)，在藍(lán)莓組織培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞分裂素對(duì)芽的誘導(dǎo)和增殖起到至關(guān)重要的作用，其中ZT 是藍(lán)莓叢生芽誘導(dǎo)和增殖中使用最為廣泛的一種，且其用量在藍(lán)莓不同品種中也存在差異，所以值得進(jìn)一步探究適合藍(lán)莓斯巴坦增殖的ZT 濃度。

試驗(yàn)利用正交設(shè)計(jì)進(jìn)行了極差和方差分析，比較了影響藍(lán)莓斯巴坦增殖的主要因素，以此篩選出藍(lán)莓斯巴坦增殖組織培養(yǎng)適宜的培養(yǎng)條件。在植物離體快繁中，支撐物、培養(yǎng)基以及ZT 濃度都會(huì)影響組培苗的生長(zhǎng)和分化，其中支撐物對(duì)增殖系數(shù)和芽高的影響最大。該研究結(jié)果表明藍(lán)莓斯巴坦在以珍珠巖為支撐物時(shí)，長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于以瓊脂為支撐物和以蛭石為支撐物。當(dāng)支撐物相同時(shí)，以WPM 為營(yíng)養(yǎng)液的處理效果最佳，增殖系數(shù)和芽高都好于其他2 個(gè)濃度。以瓊脂為支撐物，處理1 和處理2 芽數(shù)相對(duì)較多且較高；處理3 的平均芽數(shù)相對(duì)較少，葉片呈淡綠色。以珍珠巖為支撐物，處理4、處理5 的芽在高度上明顯高于其他處理，且葉片呈綠色；處理4 的增殖系數(shù)高達(dá)5.14，生長(zhǎng)旺盛，分支多，植株粗壯，而且植株較高。以蛭石為支撐物，處理7、處理8 和處理9 的芽相對(duì)較矮，且數(shù)量少，但是葉片都呈綠色。通過(guò)試驗(yàn)得到如下結(jié)論：藍(lán)莓最適叢生芽增殖的培養(yǎng)基為珍珠巖+WPM+1 mg/L ZT，對(duì)組培育苗技術(shù)的推廣應(yīng)用具有重要意義。