薛莉君，劉碧林，楊 洋，王 園，陳 敏

(1.重慶化工職業(yè)學(xué)院 制藥工程學(xué)院，重慶 401228；2.遵義醫(yī)科大學(xué) 第五附屬(珠海)醫(yī)院，珠海 519000)

泰地羅新(TIP)，化學(xué)式C41H71N3O8，CAS號(hào)328898-40-4，是新型動(dòng)物專用半合成抗菌藥，屬于大環(huán)內(nèi)酯類泰樂菌素的衍生物[1-3]，其抑菌活性主要是通過與敏感菌的核糖體50S亞基結(jié)合來抑制敏感菌的肽鏈和蛋白質(zhì)合成[4-6]來體現(xiàn)的。TIP 一般用于防治豬、牛呼吸道系統(tǒng)疾病[7-9]，具有一次給藥全程治療、生物利用度高、半衰期長(zhǎng)、性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，其療效優(yōu)于泰樂菌素。人若長(zhǎng)期誤食，會(huì)導(dǎo)致胃腸道菌群失調(diào)，身體免疫功能低下等。2011年，歐洲藥品管理局(EMA)批準(zhǔn)荷蘭英特威國(guó)際有限公司生產(chǎn)的TIP 注射液(商品名:Zuprevo)在歐盟國(guó)家上市銷售，并規(guī)定TIP在豬各種組織中的最高殘留限量(MRL)分別為:皮膚和脂肪0.8 mg·kg－1，肌肉1.2 mg·kg－1，肝臟5.0 mg·kg－1，注射部位7.5 mg·kg－1，腎臟10.0 mg·kg－1；2012年，美國(guó)聯(lián)邦法典CFR TITLE 40/556.733 部分規(guī)定TIP在牛肝臟中的MRL 為10.0 mg·kg－1；2019 年4月，我國(guó)第158號(hào)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告批準(zhǔn)TIP 作為新獸藥，并借鑒歐盟和國(guó)際食品法典委員會(huì)的相關(guān)制度而制定了TIP 在豬各種組織中的MRL:皮膚和脂肪0.8 mg·kg－1，肌肉1.2 mg·kg－1，肝臟5.0 mg·kg－1，腎臟10.0 mg·kg－1。監(jiān)控TIP 殘留量對(duì)于保障禽畜肉及其制品質(zhì)量安全具有十分重要意義。

目前TIP 殘留量的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[10-11]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LCMS/MS)[12-16]。其中，HPLC具有檢出限較低、特異性較差的特點(diǎn)，難以分析復(fù)雜基質(zhì)樣品中的TIP殘留；LC-MS/MS具有特異性強(qiáng)、檢出限高等優(yōu)點(diǎn)，可用于復(fù)雜基質(zhì)樣品中TIP 殘留的痕量分析。本工作建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)測(cè)定禽畜肉(雞肉、鴨肉、豬肉、牛肉等)中TIP的方法，以期為禽畜肉中TIP的監(jiān)控及合理使用提供借鑒。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters UPLC Xevo TQ MS型超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀；BS-224S 型電子天平；Tissue-Tearor型手持式均質(zhì)儀；H1650R 型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；mini plus型純水超純水一體機(jī)；Oasis HLB型固相萃取柱。

TIP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:10 mg·L－1，稱取1.0 g TIP標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至100.0 mL。

TIP標(biāo)準(zhǔn)溶液:1.0 mg·L－1，移取1 mL TIP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用甲醇定容至10.0 mL。

TIP標(biāo)準(zhǔn)品的純度為99%；TIP 注射液(規(guī)格為50 mL:2 g)；二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、乙腈、甲醇均為色譜純；無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉均為分析純；試驗(yàn)用水為超純水；豬肉、牛肉、雞肉、鴨肉等均購(gòu)自當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 Waters BEH C18色譜柱(150 mm×2.1 mm，1.7μm)，柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10.0μL；流動(dòng)相:A 為乙腈，B 為0.1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)三氟乙酸溶液；流量0.2 mL·min－1。梯度洗脫程序:0～1.0 min時(shí)，A 為10%；1.0～3.0 min時(shí)，A 由10%升至90%；3.0～5.0 min時(shí)，A 為90%；5.0～7.5 min 時(shí)，A 由90% 降至10%；7.5～10.0 min時(shí)，A 為10%。

2)質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)；離子源溫度750 ℃；電噴霧電壓5.0 kV；脫溶劑氣溫度650 ℃；毛細(xì)管電壓2.3 kV；碰撞氣氬氣的純度大于99.99%；霧化氣氮?dú)獾募兌却笥?9.99%；定性離子對(duì)m/z734.5/174.1；定量離子對(duì)m/z734.5/98.1；錐孔電壓40 V；碰撞能量80 eV。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取粉碎均勻的樣品2.0 g于50 mL 離心管中，加入70%(體積分?jǐn)?shù))乙腈溶液20 mL，渦旋混勻1 min，依次加入氯化鈉2 g、無(wú)水硫酸鎂5 g，以8 000 r·min－1的轉(zhuǎn)速勻漿萃取10 min，以10 000 r·min－1的轉(zhuǎn)速離心5 min，收集上清液。依次用甲醇3 mL和水3 mL活化HLB固相萃取柱后，將上清液過柱(控制流速1滴/2～3 s)，并依次用水3 mL、甲醇3 mL洗滌，5%(體積分?jǐn)?shù))氨水甲醇溶液5 mL洗脫，收集洗脫液，于45 ℃吹氮至近干，用乙腈溶解殘?jiān)?，并定容?.0 mL，過0.22μm微孔濾膜，濾液按儀器工作條件測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用蠕動(dòng)泵以流動(dòng)注射方式將1.0 mg·L－1TIP標(biāo)準(zhǔn)溶液注入電噴霧離子源中，分別在ESI＋和ESI－模式下進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描。結(jié)果顯示，在ESI＋模式下，TIP 具有較好的質(zhì)譜響應(yīng)，可獲得[M＋H]＋(m/z734.3)準(zhǔn)分子離子峰；對(duì)準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，在優(yōu)化的錐孔電壓和碰撞能量下，準(zhǔn)分子離子(m/z734.3)碰撞裂解生成子離子m/z561.2，392.5，194.4，173.9，156.2，97.9，66.0，其中子離子(m/z97.9)峰響應(yīng)值高，子離子(m/z173.9)峰形抗干擾性強(qiáng)，因此定量離子選擇m/z97.9，定性離子選擇m/z173.9，TIP的二級(jí)質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 泰地羅新二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.1 Secondary mass spectrum of the TIP

2.2 色譜條件的優(yōu)化

試驗(yàn)考察了不同流動(dòng)相[以甲醇、乙腈為有機(jī)相，水、0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸溶液、0.1%三氟乙酸溶液、0.02 mol·L－1乙酸銨溶液為水相]和色譜柱(Kinetex C18、BEH C18、Eclipse XDB C18、Endeavorsil C18)對(duì)含有25μg·kg－1TIP的空白基質(zhì)樣品的峰形、分離度和響應(yīng)值的影響。結(jié)果顯示:當(dāng)采用乙腈-0.1%三氟乙酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，TIP 分離度好，且質(zhì)譜響應(yīng)更高，這可能是由于TIP 結(jié)構(gòu)中含有堿性叔胺官能團(tuán)，在酸性流動(dòng)相條件下更易電離，但含量過高的三氟乙酸會(huì)抑制TIP的電離；當(dāng)采用BEH C18(150 mm×2.1 mm，1.7μm)為分析柱時(shí)，TIP可獲得較好的分離度，且峰形尖銳對(duì)稱、重現(xiàn)性好，見圖2。

圖2 泰地羅新的離子色譜圖Fig.2 Ion chromatogram of the TIP

2.3 提取溶劑的選擇

考察了水、甲醇、50%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙腈溶液、70%(體積分?jǐn)?shù)，下同)乙腈溶液、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷等提取溶劑對(duì)豬肉、牛肉、雞肉、鴨肉等4種不同禽畜肉中TIP回收率的影響，結(jié)果見表1。

由表1可知:在70%乙腈溶液中，4種禽畜肉中TIP提取回收率較高，為91.2%～97.1%，平均回收率為94.4%，因?yàn)橐译婵墒沟鞍踪|(zhì)變性沉淀，從而促進(jìn)了TIP的溶解。試驗(yàn)選擇70%乙腈溶液作為提取溶劑。

2.4 固相萃取柱的選擇

試驗(yàn)考察了HLB、C18、WCX、WAX、MCX、MAX 等含有不同極性填充料的固相萃取柱對(duì)添加了250μg·kg－1TIP的4種禽畜肉中TIP 回收率的影響，結(jié)果見表2。

表1 提取溶劑對(duì)禽畜肉中TIP回收率的影響Tab.1 Effect of extraction solvent on recovery of TIP in the 4 poultry meat %

表2 固相萃取柱對(duì)4種禽畜肉中TIP回收率的影響(n＝6)Tab.2 Effect of solid phase extraction column on recovery of TIP in the 4 poultry meat(n＝6)%

由表2可知:按固相萃取柱對(duì)TIP平均回收率由大到小依次為HLB、C18、WCX、WAX、MCX、MAX，HLB 柱對(duì)4 種禽畜肉中TIP 回收率為96.7%～98.1%，平均回收率為97.5%，凈化回收效果良好，滿足TIP殘留量的檢測(cè)需要。因此試驗(yàn)選擇HLB柱作為固相萃取柱。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)估

根據(jù)MATUSZEWSKI[14]等提出的提取后添加法評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)(ME):

式中:M1為TIP標(biāo)準(zhǔn)溶液中的測(cè)定響應(yīng)值；M2為相同TIP添加量的基質(zhì)匹配溶液的測(cè)定響應(yīng)值。

當(dāng)90%＜ME＜110%，表明不存在基質(zhì)效應(yīng)；當(dāng)ME＜90%或ME＞110%，表明存在基質(zhì)減弱效應(yīng)或增強(qiáng)效應(yīng)。試驗(yàn)考察了不同添加量的TIP 在4種不同基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)，見表3。

表3 4種禽畜肉中TIP的基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果(n＝6)Tab.3 Results of ME of the TIP in the 4 poultry meat(n＝6)

由表3可知:當(dāng)TIP添加量為25～1 000μg·kg－1時(shí)，豬肉、牛肉、雞肉、鴨肉對(duì)TIP 的測(cè)定均存在一定程度的基質(zhì)效應(yīng)，ME 為81.2%～96.4%。其中鴨肉對(duì)TIP 的測(cè)定具有明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)(ME 為81.2%～84.5%)，而豬肉、牛肉、雞肉對(duì)TIP測(cè)定的基質(zhì)效應(yīng)不顯著。為消除基質(zhì)效應(yīng)的影響，試驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量分析。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限與測(cè)定下限

分別將質(zhì)量濃度為20.0，50.0，200.0，600.0，1 200.0μg·kg－1TIP標(biāo)準(zhǔn)溶液系列添加到4種禽畜肉空白基質(zhì)樣品中，按試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，以TIP的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以TIP質(zhì)譜響應(yīng)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，TIP在4種禽畜肉空白基質(zhì)中的質(zhì)量濃度均在20.0～1 200.0μg·kg－1內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜響應(yīng)值呈線性關(guān)系，線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表4。以3倍信噪比計(jì)算方法檢出限(3S/N)，以10倍信噪比計(jì)算方法測(cè)定下限(10S/N)，結(jié)果見表4。

表4 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限與測(cè)定下限Tab.4 Linear regression equations，correlation coefficients，detection limits and lower limits of determination

由表4可知:豬肉、牛肉、雞肉、鴨肉中TIP 的檢出限為3.6～6.0μg·kg－1，測(cè)定下限為12.0～20.0μg·kg－1。

2.7 精密度和回收試驗(yàn)

在4種不同空白基質(zhì)樣品中分別加入低、中、高等3種質(zhì)量濃度的TIP標(biāo)準(zhǔn)溶液，按試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算TIP的回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表5。

表5 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.5 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表5可知:當(dāng)加標(biāo)量為25～1 000μg·kg－1時(shí)，豬肉、牛肉、雞肉、鴨肉中TIP 的回收率為92.1%～97.9%，RSD 為0.92%～6.0%，說明該方法的回收率和精密度較好，適用于禽畜肉中TIP殘留量的測(cè)定。

2.8 樣品分析

按照試驗(yàn)方法對(duì)隨機(jī)選購(gòu)的20份市售禽畜肉樣品(豬肉、牛肉、雞肉、鴨肉各5份)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示:在20份隨機(jī)禽畜肉樣品中，2份豬肉樣品中檢出了TIP 殘留，殘留量分別為54.3μg·kg－1和28.6μg·kg－1，這說明豬肉存在一定的TIP 殘留風(fēng)險(xiǎn)。

本工作建立了UPLC-MS/MS 測(cè)定禽畜肉中TIP的方法，該方法準(zhǔn)確度高、回收率好，可為禽畜肉中TIP的監(jiān)控及其合理使用提供借鑒。