范良彪，吳清實，黃麗麗，黃月群，梁美娜，張 慶?

(1.泉州師范學(xué)院 化工與材料學(xué)院，泉州 362000；2.桂林理工大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，桂林 541006)

20世紀(jì)60年代，捷克科學(xué)家Musilek V 發(fā)現(xiàn)β-甲氧基丙烯酸是由生長在腐爛木頭上的蘑菇等真菌分泌生成的具有抗菌活性的天然化合物[1]。到20世紀(jì)90年代，先正達(dá)和巴斯夫等2家公司開發(fā)了嘧菌酯和醚菌酯等甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，隨后一系列甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑逐漸被研發(fā)并投入了使用[2]。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑是通過抑制真菌線粒體呼吸，阻斷細(xì)胞色素之間電子傳遞，干擾三磷酸腺苷(ATP)產(chǎn)生，從而影響病原真菌體的能量循環(huán)，進而起到殺菌作用[3]。2018年，全球甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑銷售額累計超過30億美元，占?xì)⒕鷦┦袌龇蓊~的1/4，目前還以每年5%左右的速率增長[4]。蘑菇等真菌類食品深受廣大人民群眾的喜愛，是老百姓餐桌上的美食[5-6]。當(dāng)受甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑污染的菌類產(chǎn)品被人類誤食后，會對人體產(chǎn)生毒害作用，輕者產(chǎn)生頭暈、心悸等癥狀，重者可能導(dǎo)致嘔吐、功能紊亂等癥狀[7]。因此，加強對蘑菇等食用菌類食品中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留的監(jiān)測，具有重要的現(xiàn)實意義。

食品中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留的主要檢測方法有氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)[8-11]。其中色譜法(GC 和HPLC)檢出限高，但專屬性較差，對于微量的殺菌劑殘留適用性較差；UPLC-MS/MS價格較高，對低沸點的殺菌劑的檢測準(zhǔn)確度偏低[12-14]。本工作采用QuEChERS[15-16]-GC-MS/MS法測定蘑菇等食用菌中6種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的殘留量，以期為食用菌類食品中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留的監(jiān)測提供技術(shù)參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

島津GCMS-2010 PLUS 型氣相色譜儀；島津TQ-8040型三重四極桿質(zhì)譜儀；Quintix 2102型電子天平；YGC-36型氮吹儀；H205 R 型高速冷凍臺式離心機；Milli-Q gradient a10型超純水系統(tǒng)。

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:取啶氧菌酯、醚菌酯、嘧螨酯、醚菌胺、吡唑醚菌酯、氟嘧菌酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各1.0 mL 于10 mL 容量中，用體積比為1∶1的環(huán)己烷-乙酸乙酯溶液稀釋至刻度，搖勻，配制成10.0 mg·L－1啶氧菌酯、醚菌酯、嘧螨酯、醚菌胺、吡唑醚菌酯、氟嘧菌酯的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:取適量的甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用體積比為1∶1的環(huán)己烷-乙酸乙酯溶液稀釋，配制成0.02，0.04，0.1，0.2，0.4，1.0，2.0 mg·L－1的 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

啶氧菌酯(編號:SB05-404－2017)、醚菌酯(編號:SB05-212－2008)、嘧螨酯(編號:IST25038-100)、醚菌胺(編號:IST21241)、吡唑醚菌酯(編號:SB05-293－2015)、氟嘧菌酯(編號:1ST27017-100M)等6種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量濃度均為100 mg·L－1。

乙腈、丙酮、甲醇、環(huán)己烷、乙酸乙酯均為分析純；Qu ECh ERS萃取包(4g MgSO4和1 g乙酸鈉)，凈化管[400 mgN-丙基乙二胺(PSA)]。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 Rtx-5 MS 色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25μm)；進樣口溫度230 ℃；載氣為高純氦氣，流量1.6 mL·min－1；恒流模式；不分流進樣；進樣量1μL。柱升溫程序見表1。

表1 色譜柱升溫程序Tab.1 Program of elevation of chromatographic column

2)質(zhì)譜條件 電子轟擊離子源(EI)；離子源溫度240 ℃；轟擊能量70 eV；碰撞氣為高純氬氣；接口溫度270 ℃；溶劑延遲時間4.5 min；多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)。其他質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)Tab.2 MS parameters

1.3 試驗方法

稱取約200 g食用菌樣品，粉碎后置于自封袋中，如過夜保存，需將其置于－18 ℃環(huán)境中冷凍。稱取25.0 g 樣品于塑料離心管中，加入體積比為1∶1的環(huán)己烷-乙酸乙酯溶液25 mL，再加入Qu ECh ERS 萃取包，渦旋提取2.0 min，以10 000 r·min－1的轉(zhuǎn)速冷凍離心8 min；將上清液轉(zhuǎn)移至PSA 凈化管中，渦旋2.0 min，以10 000 r·min－1的轉(zhuǎn)速冷凍離心8 min；取10 mL上清液于刻度試管中，于60 ℃氮吹至近干，加入體積比為1∶1的環(huán)己烷-乙酸乙酯溶液1.0 mL，渦旋溶解后過0.22μm 濾膜，濾液在儀器工作條件下測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法的選擇

食用菌中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的前處理方法主要有液液萃取法、固相萃取法、凝膠凈化色譜(GPC)-濃縮法和QuEChERS提取法等。液液萃取法操作繁瑣，基質(zhì)去除不徹底，提取率較低，且易出現(xiàn)假陽性結(jié)果；固相萃取法凈化效果好，但凈化過程步驟冗長，易造成待測殺菌劑的損失，導(dǎo)致檢測準(zhǔn)確度偏低；GPC-濃縮法凈化效果好，但溶劑消耗量較大，處理時間久，儀器成本較高，不利于該方法的推廣應(yīng)用；Qu ECh ERS提取法是近年來發(fā)展起來的一種前處理方法，具有提取步驟簡單、凈化效果好，且待測殺菌劑在提取過程中損失小等特點。試驗考察了固相萃取法和Qu ECh ERS提取法等2種前處理方法對加標(biāo)量為0.1 mg·L－1的樣品中待測殺菌劑回收率的影響，結(jié)果見表3。

由表3 可知:Qu ECh ERS 提取法的回收率較高，推斷原因是固相萃取法的操作步驟較為繁瑣，凈化、富集等過程造成了待測殺菌劑的損失，而Qu ECh ERS提取法步驟簡單，待測殺菌劑在處理過程中的損失較小。試驗選擇前處理方法為Qu ECh-ERS提取法。

2.2 提取溶劑的選擇

食用菌樣品基質(zhì)比較復(fù)雜，含有大量的蛋白質(zhì)、糖類、脂肪、纖維素及礦物質(zhì)等，提取溶劑是影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確度的重要因素。合適的提取溶劑不僅能將樣品中的甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑提取完全，還能減少對基質(zhì)中的雜質(zhì)，尤其是干擾雜質(zhì)的提取。按照試驗方法進行測定，并考察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、環(huán)己烷和體積比為1∶1的環(huán)己烷-乙酸乙酯溶液等5種不同極性的提取溶劑對食用菌樣品基質(zhì)中6種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑提取效果的影響，結(jié)果見表4。

表3 前處理方法對6種殺菌劑回收率的影響Tab.3 Effect of the pretreatment method on the recovery of the 6 fungicides

表4 不同提取溶劑得到的提取回收率Tab.4 Extraction recoveries obtained with different extraction solvents

由表4可知:當(dāng)以體積比為1∶1的環(huán)己烷-乙酸乙酯溶液作為提取溶劑時，6種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑提取的效果最佳。試驗選擇體積比為1∶1的環(huán)己烷-乙酸乙酯溶液為提取溶劑。

2.3 分散固相吸附劑的選擇

QuEChERS提取法常用的分散固相吸附劑主要有C18、石墨化碳黑(GCB)、PSA 等3種萃取劑。由于食用菌樣品基質(zhì)較為復(fù)雜，含有大量的極性、中等極性和弱極性化合物，選擇合適的吸附劑，不僅能夠降低基質(zhì)成分干擾，還能提高檢測靈敏度和準(zhǔn)確度。試驗考察了上述3種吸附劑對待測樣品凈化效果的影響。結(jié)果顯示，C18萃取劑和GCB萃取劑對6種待測殺菌劑的吸附作用明顯，回收率偏低；PSA萃取劑不僅能較好地去除基質(zhì)效應(yīng)，且對6種待測殺菌劑吸附較少，檢測準(zhǔn)確度好。因此，試驗選擇PSA 作分散固相吸附劑。

2.4 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

取6種10 mg·L－1殺菌劑單標(biāo)準(zhǔn)溶液，在質(zhì)譜儀的全掃描模式進樣分析，得到各殺菌劑母離子；再采用產(chǎn)物離子掃描模式，得到各殺菌劑的產(chǎn)物離子，選擇豐度較高的3個產(chǎn)物離子作為定量離子、定性離子1和2，最后采用MRM，優(yōu)化了碰撞電壓、碰撞時間等參數(shù)。優(yōu)化后的參數(shù)見表2。6種殺菌劑的色譜圖見圖1。

圖1 6種殺菌劑的色譜圖Fig.1 Chromatogram of the 6 fungicides

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

按照儀器工作條件對甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進行測試，以6種殺菌劑的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以3倍信噪比計算檢出限(3S/N)，10倍信噪比計算測定下限(10S/N)，結(jié)果見表5。

2.6 精密度與回收試驗

按照試驗方法對香菇、金針菇和雞腿菇等3種市售常見食用菌陰性樣品進行低、中、高等3個濃度水平的加標(biāo)回收試驗，計算回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表6。

表5 線性參數(shù)、檢出限和測定下限Tab.5 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

表6 精密度和回收試驗結(jié)果Tab.6 Results of tests for precision and recovery

表6 (續(xù))

由表6可知:6種殺菌劑的回收率為83.5%～106%，RSD 為1.7%～5.0%。

2.7 重復(fù)性試驗

制備6份含0.02 mg·L－1的6種殺菌劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的陰性食用菌樣品，并按照試驗方法進行測定，計算測定值的RSD。結(jié)果顯示:啶氧菌酯、醚菌酯、嘧螨酯、醚菌胺、吡唑醚菌酯、氟嘧菌酯的RSD 分別為4.2%，3.5%，4.1%，2.7%，2.9%，3.5%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

本工作建立一種Qu ECh ERS-GC-MS/MS 測定3種食用菌中6種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留量的分析方法，該方法具有前處理速度快、操作簡便、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點，適用于食用菌類食品中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留的監(jiān)測，可為國家標(biāo)準(zhǔn)建立提供技術(shù)參考。