侯建波，張曉峰，朱曉雨，謝 文，張明哲，鄧曉軍，韓 芳，史穎珠，祝澤龍

(1.浙江省檢驗檢疫科學技術研究院，杭州 310016；2.浙江出入境檢驗檢疫局技術中心，杭州 310016；3.上海市檢驗檢疫科學技術研究院，上海 200003；4.安徽出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，合肥 230032)

牛奶具有營養(yǎng)豐富、容易消化吸收、物美價廉、食用方便等特點，備受消費者喜愛。隨著人民生活水平的提高，對牛奶的消費需求不斷增長，同時對牛奶的質(zhì)量要求越來越高。隨著我國進出口貿(mào)易的蓬勃發(fā)展，食品貿(mào)易已經(jīng)呈現(xiàn)全球化趨勢，進口產(chǎn)品已成為國內(nèi)消費者日常選擇的對象。目前市場中牛奶的銷售價格參差不齊，相同類型和規(guī)格的牛奶，由于產(chǎn)地的不同可能會帶來幾倍甚至幾十倍的價格差異，因此追溯牛奶產(chǎn)地的真實性對確定其價值具有非常重要的意義。

歐盟早在1992 年就已提出產(chǎn)地的概念，并在2000年要求在食品的生產(chǎn)、加工和流通等環(huán)節(jié)建立溯源制度，明確產(chǎn)品來源[1-3]；美國、日本等國家也相繼建立可追溯體系；我國《食品安全法》明確規(guī)定食品生產(chǎn)經(jīng)營者應當依法建立食品安全追溯體系，保證食品的可追溯性。由于生物的同位素指紋與其生長方式、生長環(huán)境密切相關，穩(wěn)定同位素溯源技術已成為追溯食品來源和實施產(chǎn)地保護的一種有效工具。該技術已成功應用于肉制品[4-8]、葡萄酒[9-11]、谷物[12-13]、茶葉[14]、蜂蜜[15]、果汁[16-17]、乳制品[18-21]等食用農(nóng)產(chǎn)品和食品的產(chǎn)地溯源研究中。已有人通過采用元素分析儀等設備串聯(lián)同位素質(zhì)譜儀測定牛奶樣品或其所含蛋白質(zhì)、氨基酸中的碳、氮、氫、氧、硫和鍶等穩(wěn)定同位素比值來對牛奶的產(chǎn)地進行溯源研究和及其產(chǎn)地歸屬情況進行分析[22-26]。還有研究人員通過紅外光譜法[27]、指紋圖譜法[28]、射頻識別技術[29]和微生物群落分析[30-31]等方法，對牛奶產(chǎn)地溯源開展研究。

本工作通過元素分析-同位素質(zhì)譜儀(EAIRMS)測定牛奶的碳、氮穩(wěn)定同位素比值(δ13C 和δ15N)，多用途氣體制備-連續(xù)流穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀(GasBench-IRMS)測定牛奶中水的氫、氧穩(wěn)定同位素比值(δ2H 和δ18O)。以牛奶的δ13C、δ15N、δ2H和δ18O 等4個指標為分析對象，同時對澳大利亞、奧地利、德國、西班牙、新西蘭、意大利和中國的牛奶樣品進行測試和統(tǒng)計比對，并對其判別牛奶產(chǎn)地溯源的可行性進行分析，提出了判別模型。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Flash型2000 型元素分析儀；Delta/Mat 252 GasBench II型多用途氣體制備儀；Delta V Advantage型穩(wěn)定同位素質(zhì)譜儀；2.5 Triad 型冷凍干燥機；CPA225D 型分析天平；錫杯(9 mm×5 mm)。

鉑(Pt)催化劑；氦氣(He)和CO2的純度不小于99.999%；O2的純度不小于99.999%；N2的純度不小于99.999%；H2的純度不小于99.999%；H2/He混合氣中H2的體積分數(shù)為1.99%；CO2/He混合氣中CO2的體積分數(shù)為0.301%。

咖啡 因(IAEA-600):δ13C＝－27.771‰ ±0.043‰(相對標準為VPDB)。

L-谷氨 酸(USGS40):δ13C＝－26.39‰ ±0.04‰(相對于VPDB-LSVEC)，δ15N＝－4.52±0.06‰(相對于空氣中的N2)。

甘氨酸(USGS65):δ13C＝－20.29±0.04‰(相對標準為VPDB-LSVEC)，δ15N＝20.68±0.06‰(相對于空氣中的N2)。

水(USGS45):δ2H＝－10.3±0.4‰(相對標準為VSMOW-SLAP)，δ18O＝－2.238±0.011‰(相對標準為VSMOW-SLAP)。

水(USGS47):δ2H＝－150.2±0.5‰(相對標準為VSMOW-SLAP)，δ18O＝－19.80±0.02‰(相對標準為VSMOW-SLAP)。

水(USGS50):δ2H＝32.8±0.4‰(相對標準為VSMOW-SLAP)，δ18O＝4.95±0.02‰(相對標準為VSMOW-SLAP)。

咖啡因(IAEA-600)、L-谷氨酸(USGS40)、甘氨酸(USGS65)、水(USGS45)、水(USGS47)、水(USGS50)均為參考氣校準物質(zhì)和質(zhì)量控制樣品。

采集的牛奶樣品主要有澳大利亞牛奶樣品35個(12個品牌)；奧地利牛奶樣品5 個(1 個品牌)；德國牛奶樣品9個(3個品牌)；西班牙牛奶樣品4個(1個品牌)；新西蘭牛奶樣品13個(4 個品牌)；意大利牛奶樣品7個(2個品牌)；中國牛奶樣品10個(8個品牌)。

1.2 儀器工作條件

1)元素分析儀(δ13C 和δ15N 的測定) He載氣流量200 mL·min－1，CO2參考氣流量90 mL·min－1，O2流量180 mL·min－1；氧化爐溫度960 ℃，還原爐溫度640 ℃，水阱溫度50 ℃。

2)GasBench(δ2H 和δ18O 的測定) H2/He或CO2/He混合氣流量100 mL·min－1，He載氣流量0.5 mL·min－1；每個樣品吹掃5 min；氣相色譜(GC)色譜柱恒溫50 ℃，進樣盤溫度25 ℃。

3)同位素質(zhì)譜儀 電子轟擊離子源(EI)，離子源電壓3.06 kV；真空度1.2×10－4Pa；電流1.5 mA；δ13C、δ15N 和δ18O 的連續(xù)測定精度小于0.06‰(n＝10)；δ2H 的連續(xù)測定精度小于0.4‰(n＝10)。

1.3 試驗方法

1.3.1δ13C和δ15N 的測定

取2μL牛奶樣品置于錫杯中，密封，通過自動進樣器進入元素分析儀，按照相應儀器工作條件進行δ13C的測定。

將牛奶進行冷凍干燥成粉末，研磨均勻，取干粉0.8 mg置于錫杯中，密封，通過自動進樣器進入元素分析儀，按照相應儀器工作條件進行δ15N 的測定。

1.3.2δ2H 的測定

取混勻的牛奶500μL 至12 mL 樣品瓶中，加入Pt催化劑，密封，樣品瓶放入自動進樣器，將H2/He混合氣通過吹掃模式充滿樣品瓶，趕出瓶內(nèi)空氣。樣品瓶密封靜止平衡60 min，使得樣品瓶中混合氣的2H/1H 與牛奶水中的2H/1H 達到同位素平衡。頂空進樣，按照相應儀器工作條件進行測定。

1.3.3δ18O 的測定

取混勻的牛奶500μL 至12 mL 樣品瓶中，密封后將樣品瓶置于自動進樣器，將CO2/He混合氣通過吹掃模式充入樣品瓶趕走瓶內(nèi)空氣。樣品瓶密封靜止平衡18 h，使混合氣CO2的18O/16O 與牛奶水中的18O/16O 達到同位素平衡狀態(tài)。頂空進樣，按照相應儀器工作條件進行測定。

1.3.4 計算方法

平行測試結(jié)果取平均值，每5個樣品穿插一個標準品進行質(zhì)量控制。各元素的穩(wěn)定同位素比計算公式如下:

式中:δ為穩(wěn)定同位素比，‰；R樣品和R標準分別為樣品和標準品中各元素的重同位素和輕同位素的豐度比，即13C/12C、15N/14N、2H/1H、18O/16O。其中δ13C的相對標準為VPDB 和VPDB-LSVEC，δ15N的相對標準為空氣中的N2，δ2H 和δ18O 的相對標準為VSMOW-SLAP。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析、Duncan 多重比較分析、聚類分析和判別分析。其中，聚類分析采用系統(tǒng)聚類，聚類距離為歐式距離，聚類方法采用組間聯(lián)接聚類法。判別分析采用Fisher線性判別分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 穩(wěn)定同位素的譜圖

按照試驗方法對標準品樣品進行測試，δ13C、δ15N、δ2H 和δ18O 譜圖見圖1。

圖1 碳、氮、氫、氧的穩(wěn)定同位素譜圖Fig.1 Spectra ofδ13 C，δ15 N，δ2 H andδ18 O

2.2 碳、氮、氫、氧穩(wěn)定同位素測試結(jié)果的地域間差異分析

按照試驗方法對澳大利亞、奧地利、德國、西班牙、新西蘭、意大利和中國等7個不同國家的牛奶中碳、氮、氫、氧穩(wěn)定同位素進行檢測，結(jié)果見圖2。對測試結(jié)果進行了方差分析，結(jié)果見表1。其中，表1中數(shù)值為平均值±標準偏差，A、B、C、D 表示存在極顯著性差異(p＜0.01)[32]；a、b、c、d表示存在顯著性差異(p＜0.05)[5]。

由圖2和表1可知:對δ13C的測試結(jié)果按從大到小的國家順序依次為中國/意大利、西班牙、德國、澳大利亞/奧地利/新西蘭。研究表明，δ13C 可能與奶牛的飼養(yǎng)方式及牧草類型有關。不同類型植物δ13C差異較大，其中C4植物的δ13C為－12.92‰～－14.38‰，明顯高于C3植物的δ13C(－24.25‰～－31.71‰)，牧草既有C3植物也有C4植物[32]。因此，不同國家牛奶中δ13C 的差異，可以反映出奶牛在飼養(yǎng)中使用的牧草類型和飼養(yǎng)方式的差異，如果飼養(yǎng)過程中以C3植物類牧草為主，則其δ13C偏小，以C4植物類牧草為主或引入玉米稈等輔料，則其δ13C含量偏大。

圖2 不同國家牛奶樣品的δ13 C、δ15 N、δ2 H 和δ18 O 分析結(jié)果Fig.2 Analytical results ofδ13 C、δ15 N、δ2 H andδ18 O in milk samples from different countries

表1 不同國家牛奶樣品的碳、氮、氫、氧穩(wěn)定同位素方差分析結(jié)果Tab.1 Results of variance analysis ofδ13 C，δ15 N，δ2 H andδ18 O in milk samples from different countries

對δ15N 的測試結(jié)果按從大到小的國家順序依次為澳大利亞、新西蘭、德國、意大利/奧地利/西班牙、中國。進口牛奶中δ15N高于國產(chǎn)牛奶。研究表明，δ15N 不但與飼料有關，還受到地域環(huán)境、氣候、土壤狀況以及生產(chǎn)方式和動物自身代謝的影響。因此不同地域牛奶中δ15N 會存在一定的差異。

對δ2H 的測試結(jié)果按從大到小的因家順序依次為澳大利亞、新西蘭、西班牙、德國、意大利、奧地利、中國。δ2H 測試結(jié)果和標準差均較大，說明牛奶的δ2H 在地域間存在較大的差異。由于氫穩(wěn)定同位素組成與當?shù)仫嬘盟芮邢嚓P，因此，可將其作為地域信息的載體用于產(chǎn)地來源的分析。

對δ18O 的測試結(jié)果按從大到小的國家順序依次為澳大利亞、新西蘭、西班牙、德國、意大利、奧地利、中國，δ18O 與δ2H 的地域排序順序基本一致。對δ2H 和δ18O 進行相關性分析，見圖3。

由圖3 可知:δ2H 和δ18O 存在一定的正相關性，所得線性回歸方程為y＝7.097x－0.113 3，相關系數(shù)為0.842 2。但由于不同地域牛奶中δ2H的測試結(jié)果差異更明顯，因此試驗選擇δ2H 反映地域差異的效果會更顯著。

圖3 牛奶樣品中δ2 H 和δ18 O 的相關性Fig.3 Correlationship betweenδ2 H andδ18 O in milk sample

2.3 碳、氮、氫、氧穩(wěn)定同位素測試結(jié)果的聚類分析

通過聚類分析，可以初步判斷不同地域牛奶中碳、氮、氫、氧測試結(jié)果的地域差異及分類效果，結(jié)果見圖4。其中，橫坐標A、B、C、D、E、F、G 分別代表德國、西班牙、意大利、澳大利亞、新西蘭、中國、奧地利。

圖4 牛奶δ13 C、δ15 N、δ2 H 和δ18 O 系統(tǒng)聚類樹形圖Fig.4 Dendrogram of clustering analysis with values ofδ13 C，δ15 N，δ2 H andδ18 O

由圖4所示，在縱坐標3.50處用實線將樹形圖切斷，可將牛奶樣品分為4類，第1類和第2類主要為澳大利亞和新西蘭的牛奶，其中也包含了少量西班牙的牛奶；第3類主要為德國和意大利的牛奶；第四類主要為中國和奧地利的牛奶，其中包含了1個意大利的牛奶。

通過對穩(wěn)定同位素測定結(jié)果的聚類分析，可以對牛奶樣品進行一定的分類和區(qū)分，可作為牛奶產(chǎn)地判別的參考指標。

2.4 碳、氮、氧、氫穩(wěn)定同位素指標對牛奶產(chǎn)地的判別分析

為了進一步確定牛奶產(chǎn)地的判別效果，了解各個指標在牛奶產(chǎn)地分析中的作用，試驗采用Fisher線性判別方法對碳、氮、氫、氧穩(wěn)定同位素測試結(jié)果等4個指標的判別能力進行比較，判別模型的可靠性采用交叉檢驗法(留一法)進行檢驗[8]，結(jié)果見表2。

表2 不同國家牛奶中碳、氮、氫、氧4種元素穩(wěn)定同位素比值測試結(jié)果的線性判別分析的交叉驗證結(jié)果Tab.2 Results of cross validation test on testing results of linear discriminant analysis on values ofδ13 C，δ15 N，δ2 H andδ18 O in milk samples from various countries

由表2可以看出:在區(qū)分牛奶地域來源時，單一指標的判別效果較弱，交叉檢驗的整體判別正確率低于60%，其中δ2H 指標的判別效果略優(yōu)于其他指標。將測試結(jié)果進行組合后，判別正確率明顯提升，δ13C、δ15N 和δ2H 等3項指標組合交叉檢驗整體判別正確率達到84.3%，其中澳大利亞和新西蘭存在相互誤判的情況。由于δ2H 和δ18O 存在一定的相關性，在引入δ18O 后，整體判別正確率并未提升，因此可采用δ13C、δ15N 和δ2H 組合指標對牛奶產(chǎn)地進行判別分析。

對δ13C、δ15N 和δ2H 組合指標進行判別函數(shù)和方差貢獻率分析。根據(jù)SPSS軟件給出的數(shù)據(jù)，判別函數(shù)1方差貢獻率88.8%，同時包含了δ13C、δ15N 和δ2H 的信息；判別函數(shù)2 的方差貢獻率8.1%，主要包含δ13C 和δ2H 的信息。判別函數(shù)3的方差貢獻率3.1%，主要包含δ15N 的信息。因此推測δ13C、δ2H 是牛奶產(chǎn)地判別的主要參考指標，其次是δ15N。當采用δ13C、δ15N 和δ2H 組合指標對不同國家牛奶樣品進行區(qū)分時發(fā)現(xiàn)，除了德國和意大利存在部分牛奶重疊的情況、澳大利亞和新西蘭的牛奶產(chǎn)地區(qū)分效果略差等問題，組合指標可以對不同國家的牛奶進行區(qū)分。利用牛奶中δ13C、δ15N和δ2H 組合指標建立的判別模型依次是Y(澳大利亞)＝261.78－13.82δ13C＋25.72δ15N－0.38δ2H、Y(奧地利)＝－250.32－14.53δ13C＋22.07δ15N－0.28δ2H、Y(德國)＝－194.36－11.72δ13C＋21.80δ15N－0.07δ2H、Y(新西蘭)＝－273.18－14.54δ13C＋24.16δ15N－0.29δ2H、Y(西班牙)＝－159.48－10.91δ13C＋19.25δ15N－0.17δ2H、Y(意大利)＝－165.70－10.56δ13C＋20.22δ15N－0.20δ2H 和Y(中國)＝－130.69－9.45δ13C＋13.59δ15N－0.48δ2H。

對來自不同地區(qū)的盲樣進行鑒別歸類時，可將各樣品的測定結(jié)果分別代入上述判別模型，比較各地域Y值大小，并將盲樣歸屬于Y值最大的地域。

本工作通過元素分析-同位素質(zhì)譜法和多用途氣體制備-連續(xù)流穩(wěn)定同位素質(zhì)譜分析法，分別對澳大利亞、奧地利、德國、西班牙、新西蘭、意大利和中國等7個地域牛奶的碳、氮、氫、氧穩(wěn)定同位素指標進行測試，并對測定指標進行方差分析、聚類分析和判別分析。結(jié)果表明:碳、氮、氫穩(wěn)定同位素組合指標對牛奶地域的整體判別正確率較高(84.3%)，對于牛奶的產(chǎn)地溯源分析可以提供一些必要的信息，可作為牛奶產(chǎn)地溯源的有效參考指標，對牛奶產(chǎn)地的監(jiān)管具有一定的意義。后續(xù)研究可通過增加元素分析或紅外光譜等其他參數(shù)和技術手段進行測定和分析，進一步提高牛奶產(chǎn)品地域的判別正確率。