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        尿毒癥毒素通過刺激巨噬細胞外泌體分泌miR-22促進心肌細胞自噬*

        2020-07-06 03:55:40晏子友魏志鑫羅富里萬鳴宏
        中國病理生理雜志 2020年6期
        關(guān)鍵詞:外泌體尿毒癥心肌細胞

        晏子友,魏志鑫,羅富里△,萬鳴宏

        (1江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,江西南昌330006;2江西中醫(yī)藥大學(xué),江西南昌330000)

        大量證據(jù)表明,尿毒癥毒素,特別是蛋白結(jié)合類亞群,如硫酸吲哚酚(indoxyl sulfate,IS),不能通過日常血液透析有效清除,是心血管疾病的主要危險因素之一[1-2]。先前的一項臨床研究表明,高血清IS水平與慢性腎臟疾病(chronic kidney disease,CKD)患者的心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)死亡率相關(guān)[3]。最近,有研究證實了IS在體外可通過增強氧化應(yīng)激上調(diào)心肌細胞的自噬水平[4]。但是,目前尚不清楚IS誘導(dǎo)心肌細胞自噬的更深層機制。微小RNA(microRNA,miRNA,miR)是小的內(nèi)源性非編碼RNA,在細胞增殖、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。據(jù)報道,miR-22是一種進化保守的miRNA,在心臟組織中高度表達,并可作為心臟重塑的重要調(diào)節(jié)劑[5]。研究發(fā)現(xiàn)miR-22可調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細胞的自噬[6]。巨噬細胞是尿毒癥微環(huán)境的重要組成部分,在很大程度上影響著CVD的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸[7]。外泌體(exosomes,Exos)是由包括巨噬細胞在內(nèi)的多種細胞釋放的囊泡,內(nèi)含大量miRNAs[7-8]。本研究探討了IS刺激巨噬細胞分泌的外泌體對心肌細胞自噬的影響,分析IS是否通過調(diào)控外泌體的miR-22表達誘導(dǎo)心肌細胞自噬。

        材料和方法

        1 細胞培養(yǎng)

        人單核細胞株THP-1和大鼠心肌細胞株H9c2購自ATCC。THP-1細胞在含有10%胎牛血清、青霉素(1×105U/L)和鏈霉素(100 mg/L)的RPMI-1640培養(yǎng)基(HyClone)中培養(yǎng)。H9c2細胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(Thermo Scientific)中培養(yǎng)。

        2 方法

        2.1 IS刺激巨噬細胞及外泌體分離 將THP-1細胞(5×108/L)接種到10 cm培養(yǎng)皿中。加入佛波酯(130 μg/L;Sigma)誘導(dǎo)24 h,棄去上清液,加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)基,然后加入IS(500 μmol/L;Sigma)處理細胞48 h。對照組加入相同體積PBS處理。

        使用ExoQuick外泌體快速提取試劑盒(Biomars)從培養(yǎng)基上清液中分離外泌體。具體操作為:將培養(yǎng)基以3 000×g離心15 min以去除細胞和細胞碎片,然后在預(yù)沖洗的離心過濾裝置(Amicon Ultra-15;Millipore)中以5 000×g離心30 min;通過渦旋進一步將樣品與ExoQuick-TC試劑混合,孵育過夜,在4℃下以1 500×g離心30 min,取沉淀并重懸于無酶水中。

        2.2 透射電子顯微鏡法觀察外泌體 將從細胞培養(yǎng)基中獲得的沉淀物洗滌并重懸于0.2%多聚甲醛中。取3 μL重懸的沉淀物液滴在Formvar-碳涂層的鎳電子顯微鏡(Electron Microscopy Sciences)格柵上,并在室溫下孵育5 min,用1.75%乙酸鈾酰染色,PBS洗滌格柵,并使其在室溫下半干燥,然后在H7500透射電子顯微鏡(HITACHI)中觀察外泌體。

        2.3 高效液相色譜-熒光法(high-performance liquid chromatography with fluorescence detection,HPLCFLU)檢測外泌體中IS 參照文獻方法[9]用LC-20A+RF20A高效液相色譜系統(tǒng)(Shimadzu)檢測外泌體中是否存在IS。

        2.4 RT-qPCR分析巨噬細胞及其外泌體中miR-22的水平 通過RNA提取試劑盒(Promega)提取總RNA。使用PrimeScipt RT試劑盒(TaKaRa)和莖環(huán)引物(5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGAGTG-3')對分離的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。使用SYBR試劑盒(Bio-Rad)通過MX3000p實時PCR檢測系統(tǒng)(Stratagene)進行實時PCR。將反應(yīng)物在96孔板中于95℃擴增5 min;然后95℃10 s、55.7℃ 30 s,進行40個循環(huán)。通過2-ΔΔCt法計算miR-22的相對表達。miR-22和內(nèi)參照U6的正向引物序列分別為5'-GCCTGAAGCTGCCAGTTGA-3'和5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3',反向引物序列分別為5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'和5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

        2.5 巨噬細胞外泌體對H9c2細胞活力的影響H9c2細胞以每孔4×104個接種于96孔板,分為對照組和不同濃度外泌體組,每組設(shè)3個平行復(fù)孔。不同濃度外泌體組分別加入含10、20、30、40和50 mg/L外泌體的培養(yǎng)液;對照組加入不含外泌體等體積的培養(yǎng)液處理。處理48 h后,使用CCK-8試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)評估細胞活力。在37℃的黑暗環(huán)境中溫育1 h后,用Synergy HT多功能酶標儀(BioTek)測量每個孔在450 nm的吸光度(A)。

        2.6 巨噬細胞外泌體進入H9c2細胞的內(nèi)在化 將巨噬細胞外泌體在37℃的黑暗環(huán)境中用PKH26(Sigma)標記15 min后在PBS中洗滌3次,并在4℃以100 000×g離心2 h。然后,將標記的外泌體添加到制備的H9c2細胞中分別共培養(yǎng)12和21 h。溫育后,將細胞用PBS洗滌1次,并用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)的 PBS將細胞核染色5 min。使用熒光顯微鏡觀察H9c2細胞攝取巨噬細胞外泌體的情況。

        2.7 Western blot檢測H9c2細胞中外泌體表面標志蛋白CD63及自噬相關(guān)蛋白P62和LC3的表達 使用RIPA裂解緩沖液從經(jīng)外泌體處理的H9c2細胞中(處理方法同2.5)提取總蛋白質(zhì)。BCA定量后,在聚丙烯酰胺凝膠上電泳,將蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜與Ⅰ抗[抗CD63、P62、LC3及GAPDH抗體(1∶1 000);購自Cell Signaling Technology]在4℃孵育過夜。將膜與Ⅱ抗(1∶8 000;購自Abcam)在室溫下孵育2 h。使用增強型化學(xué)發(fā)光試劑檢測免疫復(fù)合物。

        2.8 細胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的H9c2細胞,以每孔5×104個接種于24孔板,每孔加入含20 mg/L外泌體的培養(yǎng)液。然后用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑(Sigma)分別將miR-22模擬物(miR-22 mimic)和miR-22抑制物(miR-22 inhibitor)轉(zhuǎn)染入細胞。加入相應(yīng)的亂碼miRNA作為對照(mimic NC和inhibitor NC)。處理48 h后,收集細胞并進行上述測定。

        3 統(tǒng)計學(xué)處理

        采用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)分析。所有實驗獨立重復(fù)至少3次,結(jié)果采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。使用單因素方差分析(one-way ANOVA)和獨立樣本t檢驗分析組間差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        結(jié) 果

        1 IS對巨噬細胞及其分泌的外泌體和H9c2細胞中miR-22表達的影響

        在IS刺激下,通過透射電子顯微鏡在巨噬細胞培養(yǎng)基中觀察到直徑在40~100 nm之間的圓形結(jié)構(gòu),見圖1A,并且IS刺激的巨噬細胞中外泌體表面標志蛋白CD63的水平顯著高于對照組(P<0.05),見圖1B,表明巨噬細胞在IS刺激下可分泌外泌體。此外,HPLC-FLU分析顯示IS已在外泌體提取過程中被清除掉,見圖2。與對照組相比,IS組巨噬細胞及其分泌的外泌體和H9c2細胞中miR-22的水平均顯著上調(diào)(P<0.01),見圖3。

        Figure 2.HPLC-FLU analysis chromatogram of IS.A:macrophage-derived exosomes;B:macrophage-derived exosomes+IS.圖2 IS的HPLC-FLU分析色譜圖

        2 外泌體進入H9c2細胞的內(nèi)在化

        外泌體與H9c2細胞共培養(yǎng)12 h后,部分PKH26標記的外泌體位于H9c2細胞的細胞質(zhì)中;21 h后,可見大部分外泌體位于H9c2s細胞的細胞質(zhì)中,見圖4。這些數(shù)據(jù)表明,巨噬細胞外泌體可被內(nèi)化到H9c2細胞中。

        3 外泌體對H9c2細胞自噬的影響

        Figure 3.The effect of IS on expression of miR-22 in the macrophages,macrophage-derived exosomes(Exos) and H9c2 cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs control group.圖3 IS對巨噬細胞及其分泌外泌體和H9c2細胞中miR-22表達的影響

        使用CCK-8法測定H9c2細胞的活力,結(jié)果顯示,隨著外泌體濃度的增大,H9c2細胞的活力逐漸降低(P<0.05),見圖5A。與對照組相比,不同濃度外泌體均可顯著上調(diào)H9c2細胞中miR-22的水平,這種影響呈劑量依賴性(P<0.05),見圖5B。除了細胞活力降低和miR-22水平增加外,Western blot分析顯示,巨噬細胞外泌體的刺激降低了H9c2細胞P62的表達,并促進了LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化,這種變化呈劑量依賴性(P<0.05),見圖5C,表明巨噬細胞外泌體刺激提高了H9c2細胞的自噬水平。

        Figure 4.Representative photos of the H9c2 cells uptaking PKH26-labeled macrophage-derived exosomes at 12 and 21 h.圖4 PKH26標記的巨噬細胞外泌體與H9c2細胞共培養(yǎng)12和21 h可內(nèi)化到H9c2細胞中

        Figure 5.Effects of macrophage-derived exosomes(Exos)on the viability and autophagy of H9c2 cells.A:the effect of Exos on the viability of H9c2 cells;B:the effect of Exos on the expression of miR-22 in the H9c2 cells;C:the effect of Exos on the protein expression of autophagy markers P62 and LC3 in the H9c2 cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs control group.圖5 外泌體對H9c2細胞活力和自噬的影響

        4 miR-22促進外泌體誘導(dǎo)的心肌細胞自噬

        在巨噬細胞外泌體刺激下,用miR-22抑制物轉(zhuǎn)染的H9c2細胞比用陰性對照miRNA轉(zhuǎn)染的細胞具有更高的活力,而與miR-22模擬物轉(zhuǎn)染的細胞相比,相應(yīng)的對照細胞表現(xiàn)出更高的活力,見圖6A。探討miR-22表達的改變是否會影響自噬的實驗結(jié)果顯示,在巨噬細胞外泌體刺激條件下,miR-22模擬物轉(zhuǎn)染的H9c2細胞與相應(yīng)的陰性對照miRNA轉(zhuǎn)染的細胞相比具有顯著更高的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率及更低的P62蛋白表達水平;而miR-22抑制物則產(chǎn)生了相反的結(jié)果,見圖6B。這些結(jié)果證實了miR-22在一定程度上參與了巨噬細胞外泌體促進心肌細胞自噬的過程。

        討 論

        透析患者的心血管疾病具有復(fù)雜且多方面的病理生理學(xué)特征,與收縮和舒張功能障礙、容量超負荷、動脈高血壓和交感神經(jīng)活化均有關(guān)[10]。除了這些傳統(tǒng)的危險因素外,越來越多的證據(jù)表明,尿毒癥毒素可能與CKD患者的CVD發(fā)展有關(guān)[2-3]。IS是腸道來源的尿毒癥毒素,近年來研究顯示其對心肌細胞和心臟成纖維細胞具有促肥大、促纖維化和促炎作用[11]。在一項針對258名尿毒癥患者的多中心研究中,IS水平升高與隨后的心力衰竭相關(guān)[12]。巨噬細胞是尿毒癥微環(huán)境的重要組成部分之一,先前研究發(fā)現(xiàn)IS可直接調(diào)控巨噬細胞的功能,促進其介導(dǎo)的心肌纖維化[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn),IS刺激下可促進巨噬細胞分泌外泌體,并且外泌體與H9c2細胞共培養(yǎng)可顯著增加H9c2細胞的自噬水平。因此,巨噬細胞分泌的外泌體可能在IS誘導(dǎo)的心肌細胞自噬中發(fā)揮重要作用。

        外泌體是新近發(fā)現(xiàn)的一類小囊泡,被認為是細胞間通信的主要方式之一,其分泌可見于包括巨噬細胞在內(nèi)的幾乎所有細胞[15]。外泌體的主要特征包括杯狀形態(tài)、40~100 nm直徑和特定脂質(zhì)筏蛋白如CD63的富集[16]。本研究觀察到巨噬細胞分泌的外泌體的直徑在40~100 nm之間,呈圓形結(jié)構(gòu)。外泌體中含有大量miRNAs,其中一些miRNAs已成為心血管疾病基因表達的重要調(diào)節(jié)因子。先前的研究表明,循環(huán)miR-22可以通過靶向p38α來促進饑餓心肌細胞的自噬[5]。此外,據(jù)報道m(xù)iR-22過表達可以促進結(jié)直腸癌細胞中的自噬,這表明miR-22在細胞自噬中具有重要作用[6]。本研究中,IS刺激可顯著促進巨噬細胞及其分泌的外泌體中miR-22的上調(diào),并且miR-22上調(diào)可顯著促進LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化,同時降低P62蛋白的表達,而轉(zhuǎn)染miR-22抑制物則產(chǎn)生了相反的結(jié)果。LC3是關(guān)鍵的自噬調(diào)節(jié)蛋白,有Ⅰ型和Ⅱ型兩個亞型,其中,LC3-Ⅱ型蛋白的生成與自噬的發(fā)生有關(guān)[17]。P62在細胞質(zhì)中合成,當自噬發(fā)生時,P62與LC3-Ⅱ蛋白結(jié)合,并在自噬溶酶體中降解[17]。因此,P62水平會隨著自噬的發(fā)生而降低。這些結(jié)果證實了miR-22參與了巨噬細胞外泌體誘導(dǎo)的心肌細胞自噬。

        Figure 6.miR-22 promoted autophagy of H9c2 cells induced by macrophage-derived exosomes(Exos).A:the effect of miR-22 mimic and miR-22 inhibitor on the viability of H9c2 cells induced by Exos;B:the effects of miR-22 mimic and miR-22 inhibitor on the protein expression of autophagy markers P62 and LC3 in the H9c2 cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs mimic NC+Exos group;#P<0.05,##P<0.01 vs inhibitor NC+Exos group.圖6 miR-22促進巨噬細胞外泌體誘導(dǎo)的H9c2細胞自噬

        綜上所述,IS刺激的巨噬細胞可通過外泌體途徑上調(diào)心肌細胞miR-22的表達,促進心肌細胞的自噬反應(yīng)。這揭示了一種新的心肌細胞在尿毒癥微環(huán)境下發(fā)生自噬的調(diào)控機制。

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