陳爍 齊孟 張穎 李向陽

B 族鏈球菌（group B streptococcus，GBS）亦稱無乳鏈球菌，是革蘭陽性球菌，常寄生于人體的直腸和泌尿生殖道，是孕晚期婦女和新生兒感染的重要病原菌[1]。圍生期孕婦感染GBS可導(dǎo)致菌血癥、無癥狀菌尿癥、早產(chǎn)、胎膜早破、羊膜炎和傷口感染等。新生兒感染GBS可導(dǎo)致膿毒癥、肺炎、腦膜炎和敗血癥，少數(shù)出現(xiàn)蜂窩織炎[2-3]。美國疾病與控制中心預(yù)防新生兒GBS感染的指南推薦應(yīng)對所有35～37周孕婦進(jìn)行GBS篩查[4]。我國孕前和孕期保健指南提出需要對具有高危因素的圍生期孕婦做GBS篩查[5]。篩查GBS陽性的孕婦至少在分娩前4h進(jìn)行抗菌藥物預(yù)防，可有效避免新生兒感染GBS[6]。由于孕婦用藥特殊，預(yù)防的抗菌藥物首選青霉素，若青霉素過敏，藥敏試驗(yàn)后選用頭孢唑林、紅霉素、克林霉素等[7]。本文對孕晚期婦女GBS攜帶情況及大環(huán)內(nèi)酯類和林可酰胺類等藥物耐藥率及耐藥機(jī)制進(jìn)行研究，為預(yù)防和控制孕晚期婦女及新生兒GBS感染提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 樣本收集 收集2018年7至11月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院、育英兒童醫(yī)院產(chǎn)科848份孕晚期（35～37周）婦女的陰道或直腸（肛門括約?。┦米訕颖尽１狙芯拷?jīng)醫(yī)院倫理委員會審查通過，所有患者知情同意。

1.2 主要試劑和儀器 紅霉素紙片（15μg）、克林霉素紙片（2μg）、左氧氟沙星紙片（5μg）、萬古霉素紙片（30μg）、Mueller-Hinton（MH）瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸液肉湯培養(yǎng)基（英國Oxoid公司）、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基（20180618，鄭州人福博賽生物技術(shù)有限責(zé)任公司）、GBS顯色培養(yǎng)基（20180623，溫州市倍可特醫(yī)療器械有限公司）、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（1907G04，上海捷瑞生物工程有限公司）、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增試劑盒（AI71101A，大連Takara公司）?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS，德國Bruker公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)與鑒定 使用無菌拭子采取孕晚期婦女陰道/直腸樣本，分別接種至哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基及GBS 顯色培養(yǎng)基，5%CO2、（35±2）℃恒溫培養(yǎng)，于 24、48h判讀結(jié)果?？梢删赀M(jìn)行CAMP試驗(yàn)及MALDI-TOF MS鑒定確認(rèn)。

1.3.2 藥敏試驗(yàn) 按照美國臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI）2018年版指南進(jìn)行紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)。待測的GBS菌株經(jīng)哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)20～24h，使用無菌0.9%氯化鈉溶液將GBS配置成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙?，均勻涂布于血MH培養(yǎng)基。紙片擴(kuò)散法檢測紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星及萬古霉素耐藥性，紅霉素紙片和克林霉素紙片相距12mm，進(jìn)行D環(huán)試驗(yàn)檢測。5%CO2、（35±2）℃恒溫培養(yǎng)，20～24h 判讀結(jié)果。當(dāng)克林霉素抑菌圈臨近紅霉素紙片一側(cè)出現(xiàn)截平現(xiàn)象（D環(huán)試驗(yàn)），則為誘導(dǎo)型克林霉素耐藥。若抑菌圈內(nèi)克林霉素紙片周圍出現(xiàn)模糊生長，也為克林霉素耐藥。

1.3.3 耐藥基因檢測 取GBS單菌落于3ml腦心浸液肉湯培養(yǎng)基，35℃、120rpm搖菌培養(yǎng)，按照試劑盒說明書，提取GBS菌株全基因組。PCR檢測GBS菌株的耐藥基因 ermA、ermB、ermC、ermTR、mefA/E 和 lnuB 基因，引物序列和片段長度，見表1[8-9]。PCR體系總體積20μl，滅菌雙蒸水 7μl，Tap mix 10μl，上游下游引物各 1μl，模板 DNA1μl。擴(kuò)增條件：95°C 預(yù)變性 5min，95°C 變性30s，43～49°C 退火 30s，72°C 延伸 1min，共 35 個循環(huán)，72°C 10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，出現(xiàn)相應(yīng)條帶即為陽性。PCR產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測序，將ermB、ermTR、mefA/E和lnuB基因測序結(jié)果與NCBI中已有的耐藥基因序列（NG_047798.1、AF_002716.1、NG_047963.1、NG_047921.1 等）進(jìn)行BLAST比對。

2 結(jié)果

2.1 GBS檢出情況 848份樣本中共檢出95株GBS，陽性率為11.2%。其中哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基檢出57株，GBS顯色培養(yǎng)基檢出92株（3株不溶血GBS未檢出）。

表1 PCR擴(kuò)增耐藥基因引物序列和片段長度

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 95株GBS中紅霉素耐藥75株，中介1株，敏感19株；克林霉素耐藥78株，敏感17株；左氧氟沙星耐藥29株，敏感66株；萬古霉素全部敏感。具體藥敏結(jié)果見表2。3種抗菌藥物同時耐藥占28.4%（27/95）；左氧氟沙星耐藥株中，93.1%（27/29）為紅霉素和克林霉素耐藥株。

表2 95株GBS藥敏試驗(yàn)結(jié)果[株（%）]

2.3 耐藥表型檢測結(jié)果 經(jīng)D環(huán)試驗(yàn)檢測，95株GBS中69株為紅霉素克林霉素結(jié)構(gòu)耐藥表型（cMLSB），占72.6%、5株為紅霉素誘導(dǎo)克林霉素耐藥表型（iMLSB，D環(huán)試驗(yàn)陽性）、1株為紅霉素耐藥、克林霉素敏感表型（M）、3株為紅霉素敏感、克林霉素耐藥表型（L）。

2.4 耐藥基因檢測結(jié)果 PCR檢測到59株攜帶ermB基因、29株攜帶mefA/E基因，19株攜帶lnuB基因，2株攜帶ermTR基因，未檢測到ermA、ermC基因。1株cMLSB和2株L型未檢測到耐藥基因。1株紅霉素中介、克林霉素敏感株檢到mefA/E基因，1株紅霉素克林霉素雙敏感株檢到mefA/E和lnuB基因。具體耐藥表型與基因型關(guān)系見表3，基因電泳圖見圖1。

3 討論

本次篩查顯示孕晚期婦女GBS陽性率為11.2%，提示攜帶率高，需要對所有孕晚期婦女進(jìn)行GBS篩查。此次篩查采用的GBS顯色培養(yǎng)基檢出率較血瓊脂培養(yǎng)基高，但無法檢測極少數(shù)不溶血GBS，綜合判斷有助于更準(zhǔn)確篩查。

本研究中篩查出的GBS對紅霉素、克林霉素、左氧氟沙星的耐藥率分別為78.9%、82.1%、30.5%，萬古霉素全敏感，3種藥物同時耐藥的占28.4%，紅霉素和克林霉素耐藥率相較本院2015年耐藥率（71.0%，69.9%）升高，紅霉素和克林霉素耐藥率較歐洲、北美、南非等地耐藥率高[10-11]。耐藥率上升可能與近年來紅霉素與克林霉素在女性泌尿生殖道治療中的廣泛應(yīng)用，尤其是支原體的治療相關(guān)[12]。左氧氟沙星耐藥株中，93.1%為紅霉素和克林霉素耐藥株，提示左氧氟沙星耐藥株，其紅霉素和克林霉素極可能耐藥，可以進(jìn)一步探討之間的關(guān)系。2018年版CLSI提示，對青霉素過敏孕婦的GBS分離株需要做藥敏試驗(yàn)，并進(jìn)行誘導(dǎo)型克林霉素耐藥試驗(yàn)，若D環(huán)試驗(yàn)陽性，則應(yīng)報告克林霉素耐藥。目前發(fā)現(xiàn)GBS對青霉素的敏感性有所下降，由于孕婦用藥特殊性，對孕晚期婦女GBS的耐藥監(jiān)測，需要引起足夠重視[13-14]。

目前報道的GBS對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥主要由erm基因和mef基因介導(dǎo)。erm基因編碼23S rRNA甲基化酶，改變抗菌藥物靶位點(diǎn)的結(jié)合，阻止大環(huán)內(nèi)酯類和林可酰胺類抗菌藥物與核糖體亞基結(jié)合。mefA/E基因編碼外排泵介導(dǎo)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥。lnuB基因編碼核苷酸轉(zhuǎn)移酶導(dǎo)致克林霉素耐藥[10]。GBS經(jīng)D環(huán)試驗(yàn)檢測，主要耐藥表型為cMLSB，占90.9%，這與北京、東莞等研究相似，證明我國大部分地區(qū)以cMLSB耐藥表型為主[9，15]。

此次研究中，ermB基因攜帶率最高，為62.1%；mefA/E、lnuB和ermTR基因攜帶率分別為30.5%、20.0%和2.1%。ermB、mefA/E基因攜帶率與我國其他地區(qū)報道相似，與歐美、巴西等地相差較大，lnuB攜帶率明顯高于北京、廣東等地區(qū)[15-16]。有研究者認(rèn)為，lnuB基因在GBS中可能不傳播或以極低頻率傳播，lnuB基因可能起源于源于腸球菌的質(zhì)粒，可移動到質(zhì)?；蛉旧w中[17]。基因型以僅攜帶ermB為主，占50.5%，其次為mefA/E，ermB+lnuB和ermB+mefA/E基因型。1株cMLSB和2株L型未檢測到耐藥基因，可能是含有其他耐藥機(jī)制。1株紅霉素、克林霉素全敏感型檢測到mefA/E+lnuB基因。有研究顯示，ermB基因單個核苷酸SNP突變會導(dǎo)致23S rRNA甲基化酶功能改變，影響大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物最低抑菌濃度（MIC）[18]。

綜上所述，溫州地區(qū)孕晚期婦女GBS攜帶率高，紅霉素和克林霉素耐藥率較高，且以cMLSB結(jié)構(gòu)耐藥表型為主，左氧氟沙星耐藥株其紅霉素和克林霉素也多耐藥；ermB耐藥基因?yàn)榇蟓h(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類耐藥主要機(jī)制，lnuB基因攜帶率高于其他地區(qū)。

表3 GBS耐藥表型與基因型關(guān)系（株）

圖1 耐藥基因PCR電泳圖（Marker：DL1000Marker，1～4泳道分別為mefA/E、ermB、ermTR、lnuB 基因，5泳道為陰性對照）