王華 孟志鵬 宋鵬濤 劉靜 趙燕

機(jī)械通氣是急性呼吸窘迫綜合征等危重患者呼吸治療的主要手段，也是全麻患者術(shù)中生命安全不可或缺的保障措施；但是機(jī)械通氣相關(guān)肺損傷（ventilator-induced lung injury，VILI）等并發(fā)癥不可避免[1]。Toll樣受體 4（TLR4）/核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是VILI發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸的核心環(huán)節(jié)[2]。因此，阻斷TLR4/NF-κB信號(hào)通路、抗炎是防治VILI的關(guān)鍵。右美托咪定（dexmedetomidine，Dex）是一種新型高選擇性α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑，本課題前期研究證明Dex具有特異性抗炎并發(fā)揮肺保護(hù)的作用[3]，有研究揭示Dex減輕大鼠VILI的機(jī)制與不同程度抑制TLR4介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、減輕肺部炎性反應(yīng)密不可分[4-5]。研究表明，小窩蛋白-1（caveolin-1，Cav-1）參與機(jī)體病理、生理變化，如作用于TLR4信號(hào)通路而抑制機(jī)體炎性反應(yīng)[6]，在調(diào)控體內(nèi)炎性反應(yīng)方面起到不可或缺的作用[7]。本研究旨在觀察Cav-1在Dex干預(yù)大鼠VILI時(shí)表達(dá)的變化，進(jìn)一步明確Dex減輕肺損傷的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組與模型制備 體重225～280g、清潔級(jí)成年健康雄性SD大鼠30只，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2014-0001]，按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和管理指南進(jìn)行喂養(yǎng)和處理。恒溫環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，每組10只：對(duì)照組（C組）、VILI組（V組）、Dex預(yù)注射+VILI組（DV組）。實(shí)驗(yàn)大鼠自由飲水、禁食12h，股靜脈穿刺、置管、建立液體通道，200μg Dex（規(guī)格：200μg：2ml，批號(hào)：16100932，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）溶解于40ml 0.9%氯化鈉注射液中配置成5μg/ml Dex注射液（依據(jù)文獻(xiàn)[8]選擇Dex最佳劑量），DV組大鼠按1ml/kg經(jīng)股靜脈注射Dex注射液，C組、V組注射等量的0.9%氯化鈉注射液進(jìn)行對(duì)照；然后DV組按1ml/（kg·h）的速率持續(xù)靜脈泵注Dex注射液，C組、V組按相同速率持續(xù)靜脈泵注0.9%氯化鈉注射液，直至機(jī)械通氣期結(jié)束。20min后腹腔注射戊巴比妥鈉充分麻醉大鼠，然后置于棉墊上，仰臥位固定，備皮、消毒后行氣管切開術(shù)，插入自制氣管導(dǎo)管（靜脈穿刺針套管），氣管插管成功后C組大鼠保留自主呼吸4h，V組、VD組行機(jī)械通氣4h，使用小動(dòng)物專用呼吸機(jī)（美國(guó)Harvard公司），按文獻(xiàn)[9]設(shè)置通氣頻率40次/min、潮氣量40ml/kg、吸呼比1:1、吸入氣中的氧濃度分?jǐn)?shù)（FiO2）21%，維持呼氣末CO2分壓在35～45mmHg。4h后采取動(dòng)脈快速放血法處死大鼠，迅速分離兩側(cè)肺組織并完全取出，絲線縫扎右主支氣管，灌胃針抽取3ml；4℃0.9%氯化鈉溶液灌洗左肺3次，回收全部支氣管肺泡灌洗液（BALF），保證回收率達(dá)到80%。

1.2 肺損傷定量評(píng)價(jià)指標(biāo)（IQA）檢測(cè) 取大鼠右肺上葉組織，常規(guī)4%多聚甲醛固定、包埋、切片、蘇木素-伊紅（HE）染色。根據(jù)文獻(xiàn)[10]的方法，在光學(xué)顯微鏡（×200）50個(gè)視野下計(jì)算損傷的肺泡數(shù)目占肺泡總數(shù)的比例，即IQA。

1.3 肺組織濕干比（W/D）檢測(cè) 取大鼠右肺下葉組織，用濾紙立即吸盡其表面附著的殘余血液、水分，稱其重量為濕重（W）；然后置于70℃烤箱烘烤、脫水48h直至重量不再改變，取出再次稱其重量為干重（D）；計(jì)算兩者比值，即W/D。

1.4 BALF中clara細(xì)胞分泌蛋白16（clara cell protein-16，CC-16）及炎癥因子濃度檢測(cè) 采用ELISA法。BALF在低溫下離心10min（1 200r/min，離心半徑10cm），取上清液。使用試劑盒（美國(guó)R&D公司）測(cè)定BALF中CC-16、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-6濃度，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.5 肺組織Cav-l、TLR4及NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶（SP）法。取左肺上葉組織，多聚甲醛溶液固定，嚴(yán)格按照SP免疫組化試劑盒（北京中杉金橋公司）說明書進(jìn)行免疫組化染色。免疫組化反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物為淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒。每個(gè)標(biāo)本觀察2張病理切片，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)不同視野，Olympus相機(jī)拍照；利用Image-pro plus 6.0圖像軟件分析每張照片的累積吸光度值和面積，計(jì)算5個(gè)視野的平均吸光度值。平均吸光度值=累積吸光度值/面積，即目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 肺組織Cav-l、TLR4、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法。液氮研磨肺組織后，Trizol法提取總RNA，肺組織中RNA濃度用紫外分光光度計(jì)測(cè)定。采用兩步法RT-PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作，引物序列見表1。采用25μl反應(yīng)體系，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性 5min；95℃ 1min，56℃40s，72℃40s，循環(huán) 40次；72℃延伸 10min；4℃保存。使用 RTPCR儀（Light Cyeler 480，美國(guó)Roche公司）檢測(cè)各樣本的域值循環(huán)數(shù)（CT）值，利用△CT法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 目的基因引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠IQA及W/D比較 與C組比較，V組、

DV組IQA、W/D均明顯升高（均P＜0.05）；與V組比較，

DV組IQA、W/D均明顯下降（均P＜0.05），見表2。

表2 3組大鼠IQA及W/D比較

2.2 3 組大鼠 BALF 中 CC-16、TNF-α、IL-1β、IL-6 濃度比較 與C組比較，V組、DV組CC-16、TNF-α、IL-1β、IL-6濃度均明顯升高（均 P＜0.05）；與 V 組比較，DV組 CC-16、TNF-α、IL-1β、IL-6 均明顯下降（均 P＜0.05），見表3。

2.3 3組大鼠肺組織Cav-1、TLR4、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 與C組比較，V組、DV組Cav-1蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低，TLR4、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與V組比較，DV組Cav-1蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高，TLR4、NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05），見表 4。

2.4 3組大鼠肺組織 Cav-1、TLR4、NF-κB mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較 與C組比較，V組、DV組Cav-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低，TLR4、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與V組比較，DV組Cav-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高，TLR4、NF-κB mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表5。

3 討論

VILI是一種常見的直接肺損傷，機(jī)械應(yīng)力作用于肺組織后會(huì)改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及體內(nèi)與之相關(guān)的多種信號(hào)酶鏈，可引起肺血管內(nèi)皮和肺泡上皮直接損傷等病理變化，受損的肺組織瀑布樣釋放透明質(zhì)烷、高遷移率族蛋白等導(dǎo)致TLR4被激活，而活化的TLR4/NF-κB信號(hào)通路會(huì)引發(fā)一系列趨化因子、促炎因子蓄積、炎癥介質(zhì)釋放，應(yīng)力性肺損傷轉(zhuǎn)化肺部炎癥失衡性生物傷[11]。本研究依據(jù)文獻(xiàn)[9]介紹的方法，采用潮氣量40ml/kg機(jī)械通氣4h制備大鼠VILI模型。VILI組BALF中CC-16濃度明顯升高，肺組織內(nèi)過量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡結(jié)構(gòu)破壞、肺泡壁增厚、肺泡腔增大等改變提示模型制備成功。

CC-16是由clara細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞分泌的一種特異性功能蛋白，因其分子量小、易入血液循環(huán)的特點(diǎn)，常被用作反映肺-血管屏障功能及肺損傷嚴(yán)重程度的指標(biāo)[12]。有學(xué)者認(rèn)為BALF中炎癥因子TNF-α、IL-6濃度與VILI程度密切相關(guān)，VILI早期明顯升高可特異性反映VILI嚴(yán)重程度，或可作為診斷呼吸機(jī)相關(guān)肺炎導(dǎo)致的急性肺損傷和（或）急性呼吸窘迫綜合征的潛在生物學(xué)標(biāo)志物[13]。Cav-1是位于細(xì)胞膜小窩內(nèi)表面的的標(biāo)志蛋白和整合蛋白，在調(diào)控炎性反應(yīng)、腫瘤轉(zhuǎn)移等病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的橋梁作用。它能調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞和炎癥因子的產(chǎn)生，通過調(diào)控炎癥細(xì)胞的廣泛釋放來改善呼吸系統(tǒng)病情[14]。既往研究表明，Cav-1還可以調(diào)節(jié)人氣道上皮細(xì)胞TLR4/NF-κB信號(hào)通路活性[15-16]。然而，Cav-1在VILI病理、生理過程中的作用尚未闡明，目前存在一定的爭(zhēng)議。

眾所周知，Dex具有特異性抗炎、臟器保護(hù)等作用，是目前研究熱點(diǎn)。本研究參照文獻(xiàn)[8]并結(jié)合課題前期實(shí)驗(yàn)，DV組選擇5μg/kg預(yù)注射及5μg/（kg·h）劑量持續(xù)靜脈泵注。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)C組IQA、W/D，CC-16、TNF-α、IL-6 濃度，Cav-1、TLR4、NF-κB 蛋白及 mRNA 相對(duì)表達(dá)量均在較低水平，而VILI組IQA、W/D升高，TLR4、NF-κB蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量增加，CC-16、TNF-α、IL-6釋放增多，這表明VILI誘發(fā)了TLR4/NF-κB信號(hào)傳遞鏈啟動(dòng)，炎癥介質(zhì)隨之過量釋放，炎性反應(yīng)失衡導(dǎo)致IQA、W/D升高，導(dǎo)致VILI發(fā)生、發(fā)展。值得注意的是，本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)Cav-1蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量隨著肺部機(jī)械應(yīng)力性病變明顯下降，與預(yù)實(shí)驗(yàn)和前期研究結(jié)果相符[16]。而Cav-1的重要功能之一是通過調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路參與炎性反應(yīng)，因此本研究VILI的發(fā)生可能與Cav-1下調(diào)、TLR4/NF-κB活性增強(qiáng)有關(guān)。與V組比較，DV組肺組織Cav-1蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高，筆者推測(cè)預(yù)注射Dex能改善損傷應(yīng)激導(dǎo)致的Cav-1下調(diào)情況，保證Cav-1能繼續(xù)發(fā)揮抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路的作用，減輕炎性反應(yīng)，從而減輕大鼠VILI程度，這與Powter等[6]研究結(jié)果一致。但DV組肺損傷情況并未得到完全緩解，這說明炎性反應(yīng)是VILI發(fā)生的關(guān)鍵，但不是唯一機(jī)制，其他分子機(jī)制的參與仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，Dex能上調(diào)大鼠肺組織Cav-1表達(dá)，有效抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路，減少VILI引起的TNF-α等炎癥因子釋放，減輕肺部炎癥水腫，從而對(duì)VILI發(fā)揮保護(hù)作用。Dex減輕肺損傷的機(jī)制與上調(diào)Cav-1有關(guān)，增加Cav-1表達(dá)可能成為防治VILI藥物作用方向。對(duì)于Dex通過何種機(jī)制調(diào)控Cav-1表達(dá)，有待進(jìn)一步深入研究。