王曄，婁永江，龔芳芳，陳淑敏，張玉琦，劉英丹，孟天宇，李勇勇

(寧波大學(xué)，浙江 寧波，315211)

滸苔(Enteromorphaprolifera)俗稱(chēng)苔條，廣泛生長(zhǎng)于江蘇、浙江等東南沿海地區(qū)，是一種重要的經(jīng)濟(jì)海藻[1]。滸苔的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，其脂肪含量低，蛋白質(zhì)、纖維素及微量元素等含量豐富，還擁有獨(dú)特的風(fēng)味，深受人們的喜愛(ài)[2]。隨著人們對(duì)滸苔研究的深入，滸苔已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和食品等行業(yè)[3]。

多糖(polysaccharides, PS)是由單糖通過(guò)糖苷鍵的線性以及分支連接而成，是構(gòu)成生命活動(dòng)的重要大分子化合物。在傳統(tǒng)用途中，多糖主要用于化工醫(yī)藥基料、食品的乳化劑和增稠劑等[4]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，研究人員發(fā)現(xiàn)多糖還具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗氧化、防衰老、抗腫瘤、護(hù)肝和降血糖的作用[5]。而多糖的抗氧化作用是實(shí)現(xiàn)防衰老、抗腫瘤、護(hù)肝和降血糖等功效的重要途經(jīng)之一，主要是通過(guò)直接清除生物、化學(xué)和物理來(lái)源的多種活性氧(reactive oxygen species, ROS)，如DPPH 自由基，羥自由基和超氧陰離子等來(lái)實(shí)現(xiàn)的[6-7]。

雖然目前研究者對(duì)海藻中的化學(xué)組分進(jìn)行過(guò)研究，并且發(fā)現(xiàn)了一系列新型的化合物，但并沒(méi)有對(duì)生理活性物質(zhì)深入系統(tǒng)的研究。本文通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化滸苔多糖(Enteromorphaproliferapolysaccharide，EPP)的提取工藝，并對(duì)滸苔多糖進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)表征，并對(duì)滸苔多糖的不同組分進(jìn)行氧化活性研究和對(duì)比，以期為滸苔多糖的開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

滸苔采自浙江寧波象山。

牛血清蛋白(BSA)、考馬斯亮藍(lán)G-250：分析純， 阿拉丁試劑公司；氯仿、正丁醇、苯酚、濃H2SO4、NaCl、HCl,分析純。DEAE-52纖維素,景航科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YC-2低溫層析柜,北京亞泰儀器科隆有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠；HX-10-50DG臺(tái)式壓蓋多歧管冷凍干燥機(jī),上海滬析實(shí)業(yè)有限公司； NICOLET 6700智能型傅立葉紅外光譜儀(FTIR)熱電(上海)科技有限公司；1515凝膠滲透色譜儀,美國(guó)Waters公司；T6新銳可見(jiàn)分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 多糖的提取工藝流程

將滸苔用超純水沖洗干凈后置于105 ℃干燥箱中烘干至恒重，粉碎過(guò)目密封后放入干燥器中備用。稱(chēng)取不同目數(shù)的滸苔粉5 g，加入一定量的超純水混勻，在不同時(shí)間、溫度下超聲波輔助提取，6 000 r/min離心10 min。取上清液濃縮至50 mL，將濃縮后的上清液和Sevege試劑[V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1的混合溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用]倒入分液漏斗中，劇烈振蕩15 min，靜置30 min，將有機(jī)溶劑層和蛋白質(zhì)層棄去，重復(fù)以上操作直至沒(méi)有蛋白質(zhì)層出現(xiàn)。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去氯仿，透析72 h，冷凍干燥得到滸苔粗多糖。

1.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱(chēng)取10～20目、20～30目、30～40目、40～60目、60～80目的滸苔樣品5 g，在恒定條件(液料比為40∶1、浸提溫度60 ℃，浸提時(shí)間為60 min)下超聲(200 W)輔助提取，以考察不同目數(shù)對(duì)ESP得率的影響；根據(jù)上述方法固定其他因素：溫度(40、50、60、70、80 ℃)、時(shí)間(30、60、90、120、150 min)、液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1)，分別測(cè)得對(duì)粗多糖得率的影響。多糖得率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

1.3.3 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素得基礎(chǔ)之上，采用L9(34)對(duì)單因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.3.4 多糖的分離純化

稱(chēng)取40 mg的滸苔粗多糖，溶于5 mL的超純水中，上樣到DEAE-52纖維素層析柱(1.6 cm×60 cm)，依次用不同濃度的NaCl溶液(0、0.75、1.5、2.25、3 mol/L)洗脫，8 min收集1管，收集50管，以苯酚-硫酸顯色法測(cè)定每管洗脫液的吸光度并記錄。合并主要吸收峰的洗脫液，濃縮后在超純水中透析除去NaCl，冷凍干燥得精多糖。

1.3.5 滸苔多糖中總糖和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

苯酚-硫酸法測(cè)總糖[8]，Bradford 法測(cè)定多糖中蛋白質(zhì)[9]。

1.4 滸苔粗多糖氧化活性的測(cè)定

1.4.1 羥自由基清除能力的測(cè)定

參照YANG等[10]的方法，在體積比為1∶1的100 μL 0.3 mol/L的5，5′-二甲基-1-吡啶-氧化物和10 mmol/L的FeSO4混合溶液中加入多糖待測(cè)液，配制液質(zhì)量濃度為0、0.4、0.8、1.2、1.6、2 mg/mL，然后加入50 μL 10 mmol/L的H2O2溶液，最后將反應(yīng)混合液吸入毛細(xì)血管中，反應(yīng)2.5 min后用Brucker A320光譜儀記錄ESR光譜圖。羥自由基清除率計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：H0，空白組ESR圖譜第二峰信號(hào)強(qiáng)度；HX，實(shí)驗(yàn)組ESR圖譜第二峰信號(hào)強(qiáng)度。

1.4.2 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參照HU等[11]的方法，將2 mL的質(zhì)量濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2 mg/mL的待測(cè)溶液與2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液在室溫下避光混合搖勻，靜置30 min。在517 nm處測(cè)定吸光度(A試樣)。按照以上操作，分別測(cè)定A空白(空白為樣品與無(wú)水乙醇各2 mL混合液)和A對(duì)照(對(duì)照為DPPH和無(wú)水乙醇各2 mL混合液)的吸光度。DPPH自由基清除率計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

式中：A0、A試樣、A對(duì)照分別為空白、試樣和對(duì)照組的吸光度。

1.4.3 超氧陰離子清除力的測(cè)定

參考騰浩等[12]的方法，將0.5 mL質(zhì)量濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2 mg/mL多糖樣品溶液、4.5 mL的Tris-HCl緩沖液和0.1 mL 3 mmol/L的鄰苯三酚溶液加入到10 mL的試管中，25 ℃水浴加熱反應(yīng)4 min。迅速加入HCl溶液終止反應(yīng)，并在317 nm處測(cè)的吸光度，30 s間隔測(cè)1次，連續(xù)測(cè)3 min。不同組分的VC溶液為陽(yáng)性對(duì)照，空白組為0.5 mL超純水與4.5 mL Tris-HCl混合液；陰性對(duì)照組用超純水代替多糖溶液，每組平行3次，取平均值。超氧陰離子清除率計(jì)算如公式(4)所示：

(4)

式中：A0和A1分別為樣品溶液和陰性對(duì)照組的的吸光度。

1.5 紅外光譜分析

在紅外線燈下，將2 mg凍干滸苔粗多糖和分離組分和150 mg KBr用瑪瑙研缽研磨至粒度小于2 μm，裝入模具內(nèi)制成透明薄片，然后置于FTIR光譜儀樣品槽中，按照設(shè)定條件進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定前，為消除 KBr 的背景吸收，將純KBr壓片置于參考光路中。掃描范圍為 400～4 000 cm-1，分辨率為 4 cm-1。同時(shí)做空白對(duì)照。

1.6 滸苔多糖純度和分子質(zhì)量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取2 mg滸苔多糖，配制成質(zhì)量濃度為2 mg/L多糖溶液，用高效凝膠滲透色譜法(gel permeation chromtography，GPC)測(cè)定多糖分子質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果分析

2.1.1 滸苔粉碎目數(shù)對(duì)多糖得率的影響

在液料比為40 ∶1、浸提溫度60 ℃、浸提時(shí)間60 min和超聲輔助的條件下，測(cè)定滸苔粉目數(shù)對(duì)滸苔多糖提取的影響，目數(shù)設(shè)定為：10～20目、20～30目、30～40目、40～60目、60～80目。結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，滸苔多糖得率隨著目數(shù)的變小，呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，在30～40目時(shí)達(dá)到最大值13.31%，且各組滸苔多糖得率差異性顯著。有研究表明，滸苔是由單層細(xì)胞圍成管狀或粘連為帶狀的鮮綠色藻類(lèi)，細(xì)胞呈圓形，直徑在30～60 μm。目數(shù)過(guò)大，滸苔粉碎不完全，細(xì)胞壁沒(méi)有被破壞，與浸提劑的接觸面積太小，從而導(dǎo)致滸苔多糖得率較低；目數(shù)過(guò)大，滸苔多糖的得率開(kāi)始下降，可能是因?yàn)榻岵僮鬟^(guò)程中存在一定損失。

圖1 滸苔粉碎目數(shù)對(duì)滸苔多糖得率的影響
Fig.1 Effect of mesh number on polysaccharide yield ofEnteromorphaprolifera
注;不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.1.2 浸提時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

在液料比40∶1、浸提溫度60 ℃和目數(shù)40～60條件下，測(cè)定浸提時(shí)間對(duì)滸苔多糖得率的影響，時(shí)間設(shè)定為30、60、90、120、150 min，結(jié)果如圖2所示。不同時(shí)間組的滸苔多糖得率存在顯著性差異，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖得率不斷增加，在90 min時(shí)達(dá)到最大值8.91%，當(dāng)超過(guò)90 min時(shí)，多糖得率開(kāi)始下降。熱水浸提多糖是一個(gè)緩慢的過(guò)程，時(shí)間過(guò)短多糖溶解不夠完全，而時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，多糖的結(jié)構(gòu)可能開(kāi)始降解或被破壞，導(dǎo)致多糖得率降低[13-14]。

圖2 浸提時(shí)間對(duì)滸苔多糖得率的影響
Fig.2 Effect of time on polysaccharide yield ofEnteromorphaprolifera

2.1.3 浸提溫度對(duì)多糖得率的影響

在液料比為40∶1、浸提時(shí)間90 min和目數(shù)40～60目條件下，測(cè)定浸提溫度對(duì)多糖得率的影響，溫度設(shè)定為40、50、60、70、80 ℃，結(jié)果如圖3所示。隨著溫度的升高多糖得率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，在超過(guò)60 ℃以后，多糖得率趨向于穩(wěn)定，60、70 ℃多糖得率差異性不顯著。這可能是因?yàn)楫?dāng)溫度達(dá)到60 ℃以后，水溶性多糖的浸提比較完全。

圖3 浸提溫度對(duì)滸苔多糖得率的影響
Fig.3 Effect of temperature on polysaccharide yield ofEnteromorphaprolifera

2.1.4 液料比對(duì)多糖得率的影響

在浸提溫度60 ℃、浸提時(shí)間90 min和目數(shù)40～60條件下，測(cè)得液料比對(duì)滸苔多糖得率的影響，液料比設(shè)定為：10∶1、20∶1、30∶1、40∶1和50∶1，結(jié)果如圖4所示。液料比在30∶1時(shí)多糖的得率達(dá)到最大值12.32%。當(dāng)液料比繼續(xù)變大時(shí)，多糖得率開(kāi)始下降，這可能是因?yàn)榻嵋罕冗^(guò)高，減弱了超聲波對(duì)多糖提取的輔助作用，同時(shí)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的操作難度加大從而樣品損失率升高[15-16]。

圖4 液料比對(duì)滸苔多糖得率的影響
Fig.4 Effect of liquid material ratio on polysaccharide yield ofEnteromorphaprolifera

2.2 多糖提取工藝的正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果分析

多糖提取工藝正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。由表2可知各因素對(duì)滸苔多糖得率的影響程度為：A>C>B>D，即滸苔粉的目數(shù)>浸提溫度>浸提時(shí)間>液料比。由表2的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，滸苔多糖的提取最佳工藝組合為：A1B2C2D2，即在滸苔粉目數(shù)為30～40目、浸提時(shí)間90 min、浸提溫度60 ℃和液料比為30∶1條件下，滸苔多糖達(dá)到最佳提取率16.34%。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Response surface design factor level

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment results

2.3 滸苔多糖的DEAE-52纖維素柱層析結(jié)果分析

經(jīng)熱水浸提法提取的滸苔多糖為粗多糖，為了進(jìn)一步測(cè)定和分析不同組分多糖的結(jié)構(gòu)和抗氧化活性，對(duì)滸苔粗多糖進(jìn)行分離純化。稱(chēng)取40 mg凍干的滸苔粗多糖樣品溶于5 mL的超純水中，上樣至DEAE-52離子交換柱，然后用0、0.75、1.5、2.25、3 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，并測(cè)定洗脫液吸光度，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)得出3個(gè)組分，分別命名為EPP-1、EPP-2、EPP-3。

圖5 滸苔多糖的DEAE-52層析分離圖譜
Fig.5 DEAE-52 chromatogram ofEnteromorphaproliferapolysaccharides

2.4 滸苔多糖中總糖和蛋白的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖中總糖得含量，線性回歸方程為：y=8.249x+0.002 1，R2=0.997。將測(cè)得的不同組分的吸光度帶入公式計(jì)算總糖含量：EPP、EPP-1、EPP-2、EPP-3分別為35%、60.25%、59.87%和80.12%。對(duì)比發(fā)現(xiàn)純化前后的總糖含量相差較大，說(shuō)明純化后去除了大部分雜質(zhì)，純化效果較好。采用考馬斯亮藍(lán)方法測(cè)定多糖中得蛋白質(zhì)含量，用牛血清作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，得到回歸方程：y=0.8114x+0.001 2，R2=0.998。計(jì)算EPP、EPP-1、EPP-2、EPP-3的蛋白含量分別為8%、0.01%、1.9%和0.05%。對(duì)比純化前后的蛋白含量可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)純化后，蛋白含量接近于零，去除效果明顯，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)純化后得到的多糖基本無(wú)蛋白殘存。

2.5 滸苔多糖抗氧化活性研究

本研究以VC為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)測(cè)定DEAE-52層析柱分離純化得到的滸苔多糖(EPP、EPP-1、EPP-2、EPP-3)清除羥自由基、DPPH自由基、超氧陰離子的能力來(lái)分析滸苔多糖的抗氧化能力。

2.5.1 羥自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果

圖6所示為滸苔粗多糖和3個(gè)多糖分離純化組分(EPP-1、EPP-2、EPP-3)對(duì)羥自由基清除率的測(cè)定結(jié)果。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，多糖羥自由基清除率隨著濃度的升高而增強(qiáng)，說(shuō)明滸苔多糖的清除率可能有濃度依賴(lài)性，均對(duì)羥自由基有一定的清除能力，并且不同濃度之間差異性顯著(P<0.05)。羥自由基清除率最高的為粗多糖，在濃度為2 mg/mL達(dá)到62.31%，其次為EPP-3，清除能力接近于粗多糖。這與寧可[17]研究結(jié)果一致?？赡苁且?yàn)槎嗵羌兓^(guò)程中將具有清除能力的雜質(zhì)去除或是透析不完全影響了滸苔多糖的清除能力。

圖6 滸苔多糖對(duì)羥自由基的清除能力
Fig.6 scavenging capacity ofEntomorphaproliferapolysaccharides to hydroxy radicals
注：圖中不同小寫(xiě)字母表示同一組分不同濃度之間差異顯著(P<0.05), 不同大寫(xiě)字母表示同一濃度不同組分之間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.5.2 超氧陰離子清除率的測(cè)定結(jié)果

圖7所示為滸苔粗多糖和3個(gè)多糖分離純化組分(EPP-1、EPP-2、EPP-3)對(duì)超氧陰離子清除率的測(cè)定結(jié)果。不同組分的超氧陰離子清除能力呈濃度依賴(lài)性，隨著多糖質(zhì)量濃度的升高，清除能力增強(qiáng)。不同組分之間差異性顯著(P<0.05)，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，當(dāng)濃度大于0.4 mg/mL時(shí)，EPP的超氧陰離子清除能力明顯的優(yōu)于其他3組，在1 mg/mL時(shí)，清除能力達(dá)到了4組最高28.74%。

圖7 滸苔多糖對(duì)超氧陰離子的清除能力
Fig.7 scavenging capacity ofEntomorphaproliferapolysaccharides to superoxide anion

2.5.3 DPPH自由基清除率的測(cè)定結(jié)果

圖8所示為滸苔粗多糖和3個(gè)多糖分離純化組分(EPP-1、EPP-2、EPP-3)對(duì)DPPH自由基的清除能力測(cè)定結(jié)果。結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，各提取組分對(duì)DPPH自由基的清除能力隨著濃度的增加而增強(qiáng)，差異性顯著(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，DPPH自由基清除率最強(qiáng)的是EPP，但在低濃度(0.2、0.4 mg/mL)和高濃度(1.0 mg/mL)時(shí)與EPP-3差異不顯著，EPP-1和EPP-2的清除能力低于EPP和EPP-3，但兩者之間的差異性不顯著。

圖8 滸苔多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力
Fig.8 scavenging capacity ofEnteromorphaproliferapolysaccharides to DPPH free radical

2.7 滸苔多糖的紅外光譜分析

圖9 滸苔多糖的紅外光譜圖
Fig.9 infrared spectrum ofEnteromorphaproliferapolysaccharides

2.8 分子質(zhì)量和純度分析

如表3所示為GPC檢測(cè)的EPP-1、EPP-2和EPP-3的分子質(zhì)量大小以及純度。EPP-1、EPP-2、EPP-3的平均分子質(zhì)量分別為121、164、162 ku，其中EPP-1的分子質(zhì)量最小，這可能是導(dǎo)致紅外光譜圖吸收峰較弱的原因。從分散系數(shù)PI來(lái)看，3組的分散系數(shù)1.21、1.43、1.05均小于2，這說(shuō)明3個(gè)組分的純度較高，分子質(zhì)量分布均勻。

表3 滸苔多糖的GPC測(cè)定結(jié)果Table 3 GPC results of Enteromorpha prolifera polysaccharides

如圖10所示，EPP-1、EPP-2、EPP-3三個(gè)組分的多糖組成都是對(duì)稱(chēng)、均一的峰[23]。

圖10 滸苔多糖的GPC譜圖
Fig.10 GPC spectrum ofEnteromorphaproliferapolysaccharides

3 結(jié)論

本研究采用超聲波輔助的正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了滸苔多糖的提取工藝，通過(guò)DEAE-52纖維素柱對(duì)其進(jìn)行分離純化得到EPP-1、EPP-2和EPP-3三個(gè)組分，并對(duì)3個(gè)組分的體外化學(xué)抗氧化活性以及結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,3個(gè)組分對(duì)羥自由基、DPPH自由基和超氧陰離子均具有一定的清除能力，下一步將繼續(xù)對(duì)滸苔多糖體外細(xì)胞抗氧化活性進(jìn)行研究；通過(guò)紅外分析可知，EPP-1、EPP-2和EPP-3均為吡喃多糖，EPP-2可能是含有β-D-吡喃葡萄糖和蛋白質(zhì)復(fù)合的酸性多糖，EPP-3為含有β-D-吡喃葡萄糖的酸性多糖。通過(guò)對(duì)滸苔多糖結(jié)構(gòu)和抗氧化活性的研究，可為滸苔多糖具體結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。