劉芳芳，林婉玲，李來(lái)好，吳燕燕，楊少玲，黃卉，楊賢慶

1(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州，510300) 2(韓山師范學(xué)院 食品工程與生物科技學(xué)院，廣東 潮州，521041)3(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)

金鯧，學(xué)名卵形鯧鯵，是我國(guó)南方沿海重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)海水魚(yú)之一。其體型扁圓，背部呈現(xiàn)金色且有堅(jiān)硬的刺，并且含有多種人體所需的氨基酸和脂肪酸，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。近年來(lái)金鯧養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年增加，目前已突破15萬(wàn)t，曾在2013年出現(xiàn)嚴(yán)重壓塘現(xiàn)象。其無(wú)肌間刺，是魚(yú)糜加工的良好原材料，魚(yú)糜和魚(yú)糜制品的加工極大地解決了金鯧滯銷(xiāo)、庫(kù)存量較大的問(wèn)題，同時(shí)緩解了魚(yú)糜市場(chǎng)原材料匱乏的問(wèn)題。

肌球蛋白作為肌肉中含量最高的蛋白質(zhì)，也是肌肉中唯一可以單獨(dú)加熱就能形成凝膠的蛋白質(zhì)，并且已有大量研究表明肌肉組織的凝膠性、持水性以及乳化性等均與肌球蛋白結(jié)構(gòu)存在著密切的聯(lián)系[1]。因此對(duì)肌球蛋白理化特性受不同加工條件影響的研究有助于指導(dǎo)具有良好凝膠性的魚(yú)糜制品的加工[2]。肌球蛋白是以2個(gè)球狀頭部和1個(gè)棒狀尾部為骨架構(gòu)成的約160 nm的長(zhǎng)型不對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)的鹽溶性蛋白[3]。單體肌球蛋白尾部主要由α-螺旋組成，加熱使肌球蛋白變性分子結(jié)構(gòu)展開(kāi)并在蛋白質(zhì)相互作用下聚合形成有序的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。另外，漂洗和斬拌作為魚(yú)糜加工的重要步驟，對(duì)蛋白質(zhì)的變性、聚集也有一定的影響[4-5]，并且直接影響著魚(yú)糜凝膠性能的好壞。通常主要利用巰基、二硫鍵、表面疏水性以及濁度等指標(biāo)來(lái)反映蛋白質(zhì)在加工過(guò)程中的變性聚集情況，然而目前關(guān)于金鯧魚(yú)糜的研究多集中在凝膠形成工藝以及冷凍魚(yú)糜的保藏等方面[6-8]。

本研究以金鯧為原料，經(jīng)過(guò)2次漂洗和斬拌，制得漂洗魚(yú)糜和斬拌魚(yú)糜，并分別提取魚(yú)肉原料、漂洗魚(yú)糜和斬拌魚(yú)糜的肌球蛋白，同時(shí)將從斬拌魚(yú)糜中提取的肌球蛋白分別在30、40、50、60、70以及90 ℃下加熱30 min，然后測(cè)定肌球蛋白濁度、溶解度、巰基、二硫鍵、表面疏水性以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等，來(lái)研究肌球蛋白在魚(yú)糜加工過(guò)程中的變性聚集特性，為金鯧良好魚(yú)糜凝膠的加工提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大小相當(dāng)?shù)孽r活金鯧(Trachitusovatus)，于2019年5月購(gòu)自于廣州市海珠區(qū)華潤(rùn)萬(wàn)家超市，平均體重約300～400 g，本實(shí)驗(yàn)所用原料均在同一時(shí)間同一地點(diǎn)采購(gòu)。

食鹽、白砂糖(食品級(jí))，廣州海珠區(qū)客村華潤(rùn)萬(wàn)家超市；乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、三磷酸腺苷二鈉(ATP-Na2)、5、5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、乙二胺四乙酸(EDTA)、8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)以及其余常見(jiàn)試劑均為分析純，廣州領(lǐng)馭生物科技有限公司；BeyoColorTM彩色預(yù)染蛋白，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)(分析純)，美國(guó)Sigma公司；β-巰基乙醇、十二烷基硫酸鈉(SDS)(電泳級(jí))，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

IKA-T25組織勻漿機(jī)，德國(guó)IKA公司；HH-4快速恒溫?cái)?shù)顯水浴箱，常州澳華儀器公司；Sunrise-basic吸光酶標(biāo)儀，德國(guó)TECAN公司；Alpha1-4冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Christ公司；IRAffinity-1紅外光譜儀，日本島津公司；3K30臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原料制備

參考高翔等[9]制作魚(yú)糜的方法處理原料，將購(gòu)買(mǎi)的金鯧在0.5 h內(nèi)運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室，并立即宰殺清洗并攪碎(魚(yú)肉原料)，然后漂洗[水洗1次、0.2%鹽(質(zhì)量分?jǐn)?shù))洗1次，每次4 min，肉液比1∶4，水溫低于10 ℃]，漂洗后擠壓脫水，保持含水量為80%，得到漂洗魚(yú)糜，然后在常壓下斬拌[空斬5 min后加入食鹽(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%)和白砂糖(質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%)繼續(xù)斬拌10 min，斬拌溫度在4～10 ℃]，制成斬拌魚(yú)糜，然后分別提取原料、漂洗魚(yú)糜、斬拌魚(yú)糜肌球蛋白，并將斬拌魚(yú)糜肌球蛋白調(diào)節(jié)至合適濃度，然后分別在30、40、50、60、70、90 ℃加熱30 min用于后續(xù)研究。

1.3.2 肌球蛋白提取

根據(jù)PARK等[10]的方法，略作修改，整個(gè)提取過(guò)程均在10 ℃以下進(jìn)行，將樣品放置在4 ℃冰箱，3 d內(nèi)使用。

1.3.3 濁度

參考CAO等[11]，將肌球蛋白質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)至1 mg/mL，并在340 nm測(cè)定吸光值，以吸光值來(lái)表達(dá)肌球蛋白濁度大小。

1.3.4 溶解度

參考CHEN等[12]，將肌球蛋白樣品質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)至1 mg/mL，在4 ℃條件下，10 000×g離心10 min。蛋白質(zhì)溶解度定義為上清液的蛋白質(zhì)濃度除以原始肌球蛋白懸浮液的蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)溶解度計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：C1，離心后蛋白質(zhì)上清液質(zhì)量濃度；C2，離心前(原始)肌球蛋白懸浮液的質(zhì)量濃度，在本方法中，C2值為1 mg/mL。

1.3.5 總巰基和活性巰基的測(cè)定

參考WEI等[13]，略作修改。

總巰基：移取0.5 mL 4 mg/mL的肌球蛋白溶液，加入4.5 mL 0.2 mol/L Tris-HCl(含8 mol/L尿素，2%SDS，10 mmol/L EDTA，pH 6.8)的緩沖液，振蕩混勻，并加入0.5 mL 0.1%DTNB(0.1 g DTNB溶于100 mL 0.2 mol/L Tris-HCl，pH 8.0緩沖液)中，4 ℃避光反應(yīng)1 h，于412 nm處測(cè)定吸光值。

活性巰基：移取0.5 mL 4 mg/mL的肌球蛋白溶液，加入4.5 mL 0.2 mol/L Tris-HCl不含尿素的緩沖液，振蕩混勻，其余操作同上。巰基含量計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：A，412 nm處的吸光值；D，稀釋倍數(shù)，本方法為11；ε，摩爾消光系數(shù)，為13 600 mol/(L·cm)；C，蛋白溶液質(zhì)量濃度，4 mg/mL。

1.3.6 二硫鍵的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[14]，取0.5 mL 4 mg/mL的肌球蛋白溶液，向其中加入3.0 mL新配N(xiāo)TSB檢測(cè)溶液(pH 9.5)，混勻后于室溫下，避光反應(yīng)25 min，412 nm處測(cè)其吸光值。二硫鍵含量計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

式中：A，412 nm處的吸光值；D，稀釋倍數(shù)，此處為7；C，蛋白溶液質(zhì)量濃度。

新配N(xiāo)TSB檢測(cè)溶液的制備方法：用新配制的溶液(2 mol/L異硫氰酸胍，50 mmol/L甘氨酸，100 mmol/L Na2SO3，3 mmol/L EDTA，pH 9.5)以體積比1∶100稀釋NTSB原液(100 mg DTNB溶于10 mL 1 mol/L的Na2SO3溶液中，調(diào)整pH為7.5，在38 ℃恒溫條件下通O2反應(yīng)，至溶液變?yōu)榈S色終止反應(yīng))。

1.3.7 表面疏水性的測(cè)定

表面疏水性的測(cè)定參照CHENH等[15]方法，并略作改動(dòng)，取2 mL 4 mg/mL肌球蛋白溶液并加入40 μL 1 mg/mL的溴酚藍(lán)溶液，充分混合?？瞻捉M為2 mL肌球蛋白溶解液中直接加入40 μL 1 mg/mL溴酚藍(lán)溶液。將樣品置于室溫條件下振蕩10 min，然后在4 ℃條件下10 000×g離心10 min。上清液稀釋10倍后在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。表面疏水性用溴酚藍(lán)結(jié)合量來(lái)表示，表面疏水性計(jì)算如公式(4)所示：

(4)

式中：A0，表面疏水性；A1，空白組的吸光值；A2，樣品組的吸光值。

1.3.8 紅外光譜

參考林婉玲等[16]方法，將10 mg/mL的肌球蛋白溶液在-80 ℃冰箱中凍結(jié)4 h以上，然后置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥得到肌球蛋白凍干樣品。紅外光譜的測(cè)定是將肌球蛋白凍干樣品與提前干燥的無(wú)水KBr以質(zhì)量比1∶100充分研磨混勻，然后壓片。測(cè)定條件為分辨率4 cm-1，室溫下重復(fù)掃描24次，掃描范圍4 000～400 cm-1。掃描結(jié)果用Peak fit 4.12軟件進(jìn)行去卷積、二階導(dǎo)、高斯擬合，分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均采用Origin 9.0和Excel 2010進(jìn)行作圖，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組數(shù)據(jù)之間的差異用單因素ANOVA檢驗(yàn)兩兩比較的Duncan’s比較模型，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理?xiàng)l件對(duì)肌球蛋白濁度和溶解度的影響

溶解度是蛋白質(zhì)變性的一個(gè)重要指標(biāo)，較高的蛋白質(zhì)溶解性在肉制品加工中極其重要，只有蛋白質(zhì)處于高度溶解狀態(tài)時(shí)肉制品才能表現(xiàn)出來(lái)良好的凝膠性、乳化性和保水性等功能性質(zhì)[17]，濁度可以反映蛋白質(zhì)的聚集程度。不同處理?xiàng)l件對(duì)肌球蛋白濁度和溶解度的影響如圖1所示。由圖1可知，漂洗魚(yú)糜相比于原料，肌球蛋白濁度顯著下降，溶解度顯著上升，這可能主要與漂洗造成蛋白質(zhì)變性有關(guān)，而斬拌魚(yú)糜肌球蛋白濁度從0.17增加到0.67，差異顯著，表明斬拌過(guò)程中會(huì)造成更多活性巰基的暴露氧化形成二硫鍵，同時(shí)斬拌也會(huì)造成更多的蛋白質(zhì)變性解旋，表面疏水性增加，最終在這些化學(xué)作用力的共同作用下肌球蛋白發(fā)生聚集、絮凝等變化[18]，并且在斬拌過(guò)程中由于加入NaCl，有利于蛋白質(zhì)的絮凝，從而溶液中懸浮顆粒直徑增大，使光發(fā)生散射，濁度升高，并伴隨著溶解度的顯著下降。在30～90 ℃的加熱過(guò)程中，肌球蛋白濁度分別為0.67、0.74、0.76、0.82、0.86和0.94，分別在40 ℃和90 ℃時(shí)，增加幅度較大，說(shuō)明在這2個(gè)加熱溫度階段，肌球蛋白聚集更為迅速，在40 ℃時(shí)肌球蛋白聚集能力強(qiáng)，形成乳膠體，而在90 ℃時(shí)，隨著凝膠的形成，形成更大懸浮顆粒，導(dǎo)致體制濁度增大，但也有研究表明，隨著溫度升高，肌球蛋白濁度先增加，后由于更大懸浮顆粒的形成并在溶液中沉降，造成濁度減小[19]，這可能與魚(yú)種有關(guān)。溶解度的變化與濁度大致呈相反的趨勢(shì)，馮雪平[20]研究加熱溫度對(duì)鰱魚(yú)肌球蛋白理化特性的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似的結(jié)果，總之溫度對(duì)肌球蛋白的聚集行為影響較為復(fù)雜。

圖1 肌球蛋白濁度和溶解度的變化
Fig.1 Changes in turbidity and solubility of myosin
注：同一指標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 不同處理?xiàng)l件對(duì)肌球蛋白總巰基和活性巰基的影響

巰基作為肌球蛋白中具有最高反應(yīng)活性的基團(tuán)，對(duì)肌球蛋白的功能特性發(fā)揮著很大的作用，是反映蛋白質(zhì)變性的一個(gè)重要指標(biāo)。如圖2所示，在整個(gè)加工過(guò)程中，肌球蛋白總巰基含量呈持續(xù)下降趨勢(shì)，總巰基含量的下降表明了活性巰基暴露氧化形成二硫鍵，新鮮魚(yú)肉肌球蛋白總巰基含量在經(jīng)過(guò)漂洗后從6.69 mol/100g下降到6.22 mol/100g，后經(jīng)過(guò)斬拌，總巰基含量從6.22 mol/100g下降到5.69 mol/100g，2次分別減少7.0%和8.5%，無(wú)明顯差異。相比斬拌魚(yú)糜，30、40、50、60、70和90 ℃加熱，總巰基含量分別下降28.21%、28.79%、30.22%、31.46%、32.86%和43.23%，總巰基含量下降程度顯著大于漂洗和斬拌，表明了加熱是二硫鍵形成的主要原因，而低于70 ℃加熱時(shí)，總巰基含量下降程度顯著小于90 ℃加熱，這說(shuō)明高溫條件下，二硫鍵形成更多?；钚詭€基指暴露在蛋白分子表面的巰基，活性巰基的增加表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的伸展[21]。漂洗魚(yú)糜肌球蛋白活性巰基顯著增大，表明漂洗會(huì)造成肌球蛋白變性伸展，斬拌則造成活性巰基含量下降，這證明斬拌過(guò)程中肌球蛋白有輕微聚集現(xiàn)象，而蛋白質(zhì)聚合體的形成會(huì)掩蓋活性巰基。在加熱而過(guò)程中，活性巰基含量隨著溫度的升高先增加后減小，在50 ℃達(dá)到最大值，表明低溫下，肌球蛋白趨于變性，而在更高溫度下加熱，肌球蛋白逐漸趨于聚集，從而活性巰基較少。由于二硫鍵的形成與活性巰基與總巰基含量的變化緊密相關(guān)，因此，為進(jìn)一步研究在加工過(guò)程中肌球蛋白的性質(zhì)，有必要對(duì)二硫鍵的形成進(jìn)行研究。

圖2 肌球蛋白總巰基和活性巰基的變化
Fig.2 Changes in total and active sulfhydryl groups in myosin

2.3 不同處理?xiàng)l件對(duì)肌球蛋白二硫鍵的影響

分子間二硫鍵是通過(guò)相鄰蛋白質(zhì)肽鏈上具有反應(yīng)活性巰基(—SH)基團(tuán)的兩個(gè)半胱氨酸分子的氧化形成，是蛋白質(zhì)間電子共享形成的剛性化學(xué)鍵，一旦形成就不容易斷裂，是熱誘導(dǎo)蛋白質(zhì)形成凝膠的主要化學(xué)鍵。二硫鍵的形成對(duì)蛋白質(zhì)的折疊極其重要，其形成動(dòng)力學(xué)直接影響著蛋白質(zhì)折疊的速率和途徑，并對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)具有重要意義[22-23]。一般情況下，二硫鍵含量的變化在一定程度上反映了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化[24]。如圖3所示，各種處理方式都會(huì)促進(jìn)二硫鍵的形成，漂洗魚(yú)糜肌球蛋白二硫鍵含量顯著增多，這是由于含有巰基的半胱氨酸屬于敏感性氨基酸，在漂洗過(guò)程中易被氧化從而使活性巰基氧化形成二硫鍵。李賢[25]研究表明，斬拌對(duì)蛋白質(zhì)巰基含量影響較小，可能是由于暴露的巰基和包埋的巰基處于平衡狀態(tài)，并且在魚(yú)糜制作過(guò)程中，斬拌溫度一般控制在10 ℃以下，不利于二硫鍵的形成。在本次研究中，斬拌過(guò)后，二硫鍵含量略有增加，這是因?yàn)樵跀匕柽^(guò)程中空氣中的氧也會(huì)造成巰基氧化形成二硫鍵。加熱過(guò)程中，隨溫度升高二硫鍵含量增加，但高溫加熱是二硫鍵形成的主要原因。NIWA等[26]研究表明，40 ℃加熱形成凝膠化魚(yú)糜時(shí)，肌球蛋白頭部巰基含量減少，形成二硫鍵，并對(duì)凝膠的形成有一定的作用，而WENCHING等[27]通過(guò)對(duì)羅非魚(yú)肌肉中肌動(dòng)球蛋白研究發(fā)現(xiàn)，在45～75 ℃，熱處理產(chǎn)生的熱誘導(dǎo)凝膠主要是肌球蛋白和非共價(jià)鍵(疏水鍵、非二硫共價(jià)鍵等)一起構(gòu)成，而超過(guò)75 ℃時(shí)形成的熱誘導(dǎo)凝膠主要?dú)w功于二硫鍵，這主要由于不同魚(yú)種形成二硫鍵的最適溫度也不同。在本實(shí)驗(yàn)中，70 ℃加熱相比于斬拌魚(yú)糜肌球蛋白，二硫鍵含量?jī)H增加了5%，而90 ℃加熱相比于斬拌魚(yú)糜肌球蛋白，二硫鍵含量增加了20%，因此可以推測(cè)金鯧肌球蛋白二硫鍵在較高溫度形成，與總巰基含量減少的趨勢(shì)一致。由此可見(jiàn)，二硫鍵對(duì)肌球蛋白形成凝膠具有重要作用。

圖3 肌球蛋白二硫鍵的變化
Fig.3 Changes in myosin disulfide bonds

2.4 不同處理?xiàng)l件對(duì)肌球蛋白表面疏水性的影響

蛋白質(zhì)是具有復(fù)雜空間結(jié)構(gòu)的生物大分子，在外界環(huán)境改變會(huì)造成空間構(gòu)象的變化，從而影響表面氨基酸的分布，并進(jìn)一步影響表面疏水性。表面疏水性可用來(lái)表征肌球蛋白疏水基團(tuán)和極性環(huán)境的結(jié)合數(shù)目，而疏水基團(tuán)與極性環(huán)境的結(jié)合數(shù)目可以用來(lái)衡量分子間相互作用的強(qiáng)弱[28]。如圖4所示，漂洗魚(yú)糜肌球蛋白表面疏水性顯著增加(P<0.05)，而經(jīng)過(guò)斬拌后，魚(yú)糜肌球蛋白表面疏水性從18.46 μg降低到14.36 μg，表明漂洗更容易造成肌球蛋白的變性，使疏水氨基酸暴露，而斬拌魚(yú)糜肌球蛋白表面疏水性顯著降低主要是由于斬拌過(guò)程中加入鹽使蛋白質(zhì)發(fā)生聚集。在加熱過(guò)程中肌球蛋白表面疏水性先隨著溫度升高而緩慢增大，在60 ℃加熱時(shí)急劇上升，而肌球蛋白溶解度在60 ℃急劇下降，濁度較大，可以推側(cè)蛋白質(zhì)聚集表明表面疏水性增加。而后隨著溫度的升高略有下降趨勢(shì)，主要由于隨著溫度的升高，肌球蛋白疏水性側(cè)鏈暴露出來(lái)，使蛋白由水溶環(huán)境轉(zhuǎn)變成疏水性環(huán)境，蛋白聚合時(shí)又有少量疏水基團(tuán)重新包埋于肌球蛋白內(nèi)部而使表面疏水性下降。呂彤等[29]研究加熱溫度豬肉肌球蛋白表面疏水性的影響時(shí)，也有類(lèi)似的發(fā)現(xiàn)，肌球蛋白表面疏水性在65 ℃左右達(dá)到最大值，然后隨著溫度的升高表面疏水性緩慢下降。而分布在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基主要起穩(wěn)定肌球蛋白尾部的雙螺旋作用，疏水氨基酸殘基的暴露會(huì)引起肌球蛋白分子的去折疊，因此為進(jìn)一步研究加工過(guò)程中肌球蛋白的變性聚集規(guī)律，有必要對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。

圖4 肌球蛋白表面疏水性的變化
Fig.4 Changes in the surface hydrophobicity of myosin

2.5 不同處理?xiàng)l件肌球蛋白紅外光譜測(cè)定

表1 肌球蛋白紅外光譜特征吸收峰的波數(shù)Table 1 Wave numbers of characteristic absorption peaks of myosin infrared spectrum

肌球蛋白在加工過(guò)程中二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的變化如表2所示，天然肌球蛋白的β-折疊、無(wú)規(guī)則卷曲、α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量分別為16.22%、22.11%、25.31%和36.36%，漂洗后β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲含量略微減少，α-螺旋略增加，β-轉(zhuǎn)角無(wú)明顯變化，這與袁凱等關(guān)于對(duì)白鰱魚(yú)糜的二級(jí)結(jié)構(gòu)研究結(jié)果類(lèi)似[33]。斬拌魚(yú)糜肌球蛋白無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)相對(duì)含量降低了4%，而β-折疊和β-轉(zhuǎn)角分別增加3%和2%，而李賢[25]通過(guò)對(duì)鰱魚(yú)肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，隨著斬拌或者擂潰的進(jìn)行，α-螺旋解折疊展開(kāi)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)規(guī)則卷曲，這可能與斬拌時(shí)間、斬拌溫度以及魚(yú)種等有一定的關(guān)系。在30～90 ℃，隨著加熱溫度的升高，肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-折疊含量逐漸升高，α-螺旋含量逐漸減少。無(wú)規(guī)則卷曲在低于40 ℃加熱含量無(wú)明顯變化，而在高于50 ℃加熱時(shí)，無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量顯著下降。β-轉(zhuǎn)角在70 ℃以下加熱，含量無(wú)明顯變化，在70～90 ℃溫度范圍內(nèi)，其含量明顯下降。α-螺旋是緊密而無(wú)空腔的結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)過(guò)于穩(wěn)定，不利于功能特性所需要的某種構(gòu)象變化，β-結(jié)構(gòu)和無(wú)規(guī)則卷曲也是緊密有序的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，但是相比α-螺旋結(jié)構(gòu)他們的緊密程度和構(gòu)象穩(wěn)定性明顯變差，但是蛋白質(zhì)的柔韌條件明顯改善，更加有利于發(fā)揮蛋白質(zhì)的某種功能特性[34]。通常加熱條件下α-螺旋含量降低代表蛋白質(zhì)分子展開(kāi)程度增加，而β-折疊含量增加代表蛋白質(zhì)分子間聚集程度增加，β-結(jié)構(gòu)的形成是凝膠形成的基礎(chǔ)，兩者含量的增高有利于良好凝膠結(jié)構(gòu)的形成[35]。此可以推測(cè)在低溫加熱條件下，對(duì)蛋白質(zhì)凝膠結(jié)構(gòu)起穩(wěn)定作用的主要是β-轉(zhuǎn)角，而在高溫條件下主要是β-折疊起穩(wěn)定作用，賈丹[36]同樣發(fā)現(xiàn)鰱魚(yú)肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-折疊在溫度高于50 ℃才開(kāi)始形成。由此可見(jiàn)，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-結(jié)構(gòu)的變化是形成凝膠的前提。

表2 肌球蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量變化Table 2 Changes in the relative content of myosin secondary structure

3 結(jié)論

金鯧是制作魚(yú)糜制品良好的原材料，但是其凝膠強(qiáng)度相對(duì)較低，因此為了為金鯧魚(yú)糜的加工提供一定的參考，本次實(shí)驗(yàn)對(duì)金鯧肌球蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行了一定的研究。漂洗、斬拌以及不同溫度加熱對(duì)肌球蛋白理化特性均有一定的影響，漂洗過(guò)程中，肌球蛋白濁度減小，活性巰基與表面疏水性顯著增大，更易造成蛋白變性；斬拌會(huì)使肌球蛋白濁度增大，表面疏水性減少，并且總巰基顯著減少形成二硫鍵，造成蛋白質(zhì)的輕微聚集形成微凝膠；不同加熱溫度對(duì)肌球蛋白變性聚集影響差異顯著，本實(shí)驗(yàn)中，60 ℃是一個(gè)重要的加熱溫度，在低于60 ℃加熱條件下，肌球蛋白在加熱條件下是變性聚集的動(dòng)態(tài)過(guò)程，而在更高溫度加熱條件下，變性聚集的蛋白逐漸聚合，形成穩(wěn)定凝膠，伴隨著肌球蛋白濁度、溶解度、表面疏水性以及二硫鍵等均達(dá)到最大值，活性巰基與總巰基含量降到最低，α-螺旋結(jié)構(gòu)解旋形成更多的β-折疊，無(wú)規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角含量顯著減少。