田瑜琳，雒曉芳，朱雅雯，趙梓彤

（1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730030；2.西北民族大學(xué)實驗教學(xué)部，甘肅蘭州 730030）

近年來，隨著城市化的發(fā)展，水環(huán)境受到很大程度的影響，存在較為嚴重的水質(zhì)污染等問題，城市生態(tài)系統(tǒng)遭到嚴重破壞[1]。這種現(xiàn)象嚴重威脅了社會的可持續(xù)發(fā)展和人類的生活生產(chǎn)。

絮凝是當前污水處理過程中十分重要的方法，可以使水或者污水中的懸浮顆粒碰撞聚集，加快粒子沉降，是一種廣泛運用的水處理技術(shù)。常規(guī)絮凝劑通常被分為成三大類，無機絮凝劑、人工合成有機高分子絮凝劑和天然高分子絮凝劑[2]。無機絮凝劑和有機高分子絮凝劑在處理水的過程中會給水體帶來二次污染，天然高分子絮凝劑具有綠色環(huán)保無污染等優(yōu)點。近年來，微生物絮凝劑發(fā)展成為一種新興絮凝劑，這是一類由微生物產(chǎn)生并分泌到細胞外具有絮凝活性的代謝產(chǎn)物構(gòu)成的絮凝劑，一般由多糖、蛋白質(zhì)、DNA、纖維素、糖蛋白、聚氨基酸等高分子物質(zhì)構(gòu)成，分子中含有多種官能團，能使水中膠體懸浮物相互凝聚、沉淀[3]。微生物絮凝劑以其安全高效、無二次污染、來源范圍廣、生產(chǎn)周期短以及種類多等特點脫穎而出，被廣泛應(yīng)用于城市污水、印刷污水、屠宰廠污水、煤泥廢水等的處理中，成為近年來的研究熱點，具有廣闊的應(yīng)用前景。

本次試驗針對微生物絮凝劑的產(chǎn)生和絮凝效果進行研究，以雒曉芳等[9]在山東臨淄金嶺回族鎮(zhèn)的污水和淤泥中分離篩選出的志賀氏菌ZF-1作為實驗菌株，研究其產(chǎn)生的絮凝劑的絮凝特性，設(shè)計不同單因素試驗測定絮凝劑的絮凝率，分析不同因素對絮凝效果的影響。

1 實驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株來源

實驗所用菌種為雒曉芳等[9]在山東省臨淄區(qū)金嶺回族鎮(zhèn)的水渠中分離得到的有絮凝活性的菌株，經(jīng)生理生化試驗鑒定為志賀氏菌屬（Shigella Castellani），并命名為ZF-1，產(chǎn)生的絮凝劑命名為ZF-1C。

1.1.2 實驗試劑與儀器

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉浸出粉3.0 g/L，氯化鈉 5.0 g/L，pH 7.2±0.2，121 ℃高壓蒸汽滅菌 30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：0.5 g/L KCl，2.0 g/L NaNO3，0.01 g/L Fe2SO4，1.0 g/L K2HPO4，0.5 g/LMgSO4，30.0 g/L 蔗糖，121 ℃高壓蒸氣滅菌 30 min，pH 自然。

其他試劑：高嶺土、FeCl3、無水CaCl2，所有試劑均為化學(xué)純，由杭州微生物有限責任公司提供。

儀器：YXQ-LS-立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DHG-9140A新型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，寧波江南儀器廠；干燥箱，寧波江南儀器廠；LRH-150B生化培養(yǎng)箱，ZWY-200D恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；G10SUV-VIS雙光束紫外可見分光光度計，Thermo Fisher Scientific有限公司；S.SW-CJ-2F凈化工作臺，上海躍進醫(yī)療器械廠；BA210生物顯微鏡，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 生長曲線的測定

采用李靜[10]試驗中的比濁法，在660 nm處測定發(fā)酵液的濁度（OD660），用所得數(shù)據(jù)表示絮凝菌株的生長狀況，生成的曲線圖即可表示絮凝菌的生長狀況。

1.2.2 絮凝率的測定

參考姜宇等[11]的絮凝活性測定方法，進行絮凝活性的測定。

1.2.3 絮凝活性的分布

在無菌條件下，用接種環(huán)挑取一環(huán)提前復(fù)壯的ZF-1菌株，接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，將菌液置于震蕩培養(yǎng)箱中于 160 r/min、30 ℃條件下培養(yǎng) 24 h 得到種子培養(yǎng)液。取30 mL種子培養(yǎng)液加入到裝有250 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中，180 r/min、30 ℃震蕩培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)完成的發(fā)酵液 4 000 r/min 離心 30 min，所得上清液用于研究產(chǎn)絮凝劑菌株的相關(guān)絮凝活性，將沉淀用蒸餾水洗滌兩次后加入等體積的蒸餾水吹打混勻得到菌細胞懸液。依照1.2.2的方法，測定發(fā)酵液、離心上清液和菌細胞懸液的絮凝率，并比較結(jié)果。

1.2.4 絮凝劑的制備

微生物絮凝劑產(chǎn)生菌ZF-1發(fā)酵液離心后得到上清液中加入二倍體積的遇冷處理過的己醇，將其混合均勻后在4 ℃冰箱中靜置過夜，上清發(fā)酵液經(jīng)過低溫下反復(fù)的醇提，得到微生物絮凝劑ZF-1C。

1.2.5 絮凝條件的工藝優(yōu)化

微生物絮凝劑的絮凝效果除受絮凝劑本身的相對分子量、分子結(jié)構(gòu)影響外，還受絮凝劑的投加量和反應(yīng)體系的溫度、pH值、金屬離子等影響。故設(shè)計多項單因素試驗，探究絮凝劑最佳絮凝條件，對其進行工藝優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZF-1培養(yǎng)特征

在實驗過程中，為及時了解菌種在培養(yǎng)過程中的生長情況，需定時測定菌體OD660指標及絮凝效果，以便適時控制培養(yǎng)條件，從而獲得最佳培養(yǎng)物[12]。

由圖1可知，ZF-1菌株在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)到2 d時達到最高，之后生長曲線開始緩慢下降，可能是因為培養(yǎng)環(huán)境中的營養(yǎng)物消耗和代謝物的增加。絮凝率也在第2 d大幅增高，之后增加平緩，因此選取2 d作為發(fā)酵培養(yǎng)時間，以節(jié)約成本。菌種的絮凝率和生長曲線趨勢一致，在ZF-1生長繁殖的同時產(chǎn)生絮凝活性物質(zhì)。說明絮凝劑的積累伴隨著菌體的生長而增長，產(chǎn)絮主要出現(xiàn)在對數(shù)生長期，并在穩(wěn)定期持續(xù)產(chǎn)生絮凝活性物質(zhì)[13]。

圖1 ZF-1菌生長曲線及絮凝活性變化曲線

2.2 絮凝活性分布實驗

通過對發(fā)酵液、發(fā)酵上清液以及菌細胞懸液進行高嶺土懸濁液的絮凝活性測定，可以知道絮凝劑是菌體本身還是代謝產(chǎn)物。測定結(jié)果為圖2，分析ZF-1所產(chǎn)絮凝劑分布情況。

由圖2可知，發(fā)酵后的培養(yǎng)液和發(fā)酵后去菌細胞的上凊液絮凝率分別為58.5%和68.81%，菌細胞懸液的絮凝率為3.99%。試驗結(jié)果表明，ZF-1所產(chǎn)生的微生物絮凝劑是細菌在生長過程中分泌產(chǎn)生的，并不是細菌本身。為進一步提取絮凝劑和實際應(yīng)用提供了可信的依據(jù)[14]。根據(jù)以上數(shù)據(jù)分析，后續(xù)實驗使用的微生物絮凝劑ZF-1C是從離心上清液中通過低溫下反復(fù)醇提獲取的。

圖2 絮凝活性分布

2.3 絮凝劑的熱穩(wěn)定性研究

將微生物絮凝劑在100 ℃水浴中加熱15 min、30 min、45 min、60 min、75 min 后分別測定加熱后的絮凝活性，測定結(jié)果為圖3。

由圖3可知，ZF-1C有良好的熱穩(wěn)定性，在100 ℃加熱60 min的情況下，絮凝率變化幅度小于20%，在加熱至75 min時下降了23.38%。以蛋白質(zhì)為主要成分的微生物絮凝劑活性受溫度影響較大，耐熱性較差；多糖構(gòu)成的微生物絮凝劑則不受溫度的影響，耐熱性好；若為糖蛋白則取決于糖和蛋白質(zhì)的含量[15]。而ZF-1C在100 ℃加熱60 min絮凝活性變化不大，所以判定該絮凝劑是具有熱穩(wěn)定性的多糖。

圖3 100 ℃下加熱時間對絮凝效果的影響

2.4 絮凝體系pH對絮凝效果的影響

用1% NaOH溶液或1% HCl調(diào)節(jié)絮凝體系的pH。測定結(jié)果如圖4所示。

圖4 絮凝體系pH值對絮凝效果的影響

pH值能通過改變酸堿度來改變絮凝劑大分子和膠體顆粒的表面電荷、帶電狀態(tài)、中和電荷能力，從而改變顆粒之間的相互作用力，對架橋的形成產(chǎn)生影響[16]。由圖4可知，在pH為3和7時，絮凝率達到60%以上，這是因為在酸性條件下，給絮凝劑與懸浮顆粒之間提供了創(chuàng)造架橋氫鍵的氫離子，絮凝劑大分子通過氫鍵與多個膠體顆粒結(jié)合，形成較大的顆粒團塊沉淀下來[17]。在實際運用中，酸性環(huán)境會對水體造成二次污染且經(jīng)濟成本較高，故pH為7可達到最佳絮凝效果。

2.5 絮凝劑投加量對絮凝效果的影響

由圖5可知，促進絮凝的最佳絮凝劑添加量為4 mL/L。絮凝劑投加量增加至5 mL/L時絮凝活性降低，這是因為過多帶負電的絮凝劑存在，使高凝土懸著液顆粒間的靜電斥力和競爭吸附力加強，反而不利于絮凝體系的穩(wěn)定和沉淀[18]。

圖5 絮凝劑投加量對絮凝效果的影響

2.6 金屬離子對絮凝效果的影響

金屬離子能促進高嶺土懸浮液中顆粒的聚集沉降。由圖6可知，KCl、NaCl和FeCl3助凝效果較差；FeSO4具有較好的助凝作用；CaCl2助凝效果最好，并且作為助凝劑添加到絮凝體系中不會帶來二次污染。

圖6 無機金屬離子對絮凝效果的影響

一般認為，一價的金屬陽離子因只能和懸浮顆?；蛘呶⑸镄跄齽┲械囊粋€發(fā)生鍵合，所以不能連接懸浮顆粒與微生物絮凝劑；三價的金屬陽離子由于其離子強度高，會過多占據(jù)微生物絮凝劑的活性位點，不利于微生物與懸浮顆粒結(jié)合，二價金屬陽離子剛好在絮凝劑分子與懸浮顆粒間以離子鍵結(jié)合，可以促進絮凝[19]。所以二價的鈣離子和鐵離子絮凝率相對較高，其中鈣離子是最佳的助凝劑。

2.7 鈣離子濃度對絮凝效果的影響

由圖7可知，添加不同濃度的鈣離子對絮凝體系的助凝效果不同，在鈣離子濃度較低的時候，隨鈣離子濃度增加，絮凝率逐漸增高。當鈣離子濃度達到7 mmol/L 時，絮凝率最高達到 68.97%；超過 7 mmol/L后，絮凝率開始降低。多價金屬離子可以與膠體顆粒相結(jié)合后中和負電荷，使膠體減少靜電斥力，更易形成絮體，然后在微生物絮凝劑的作用下形成更大的絮團，但過量的金屬離子會占據(jù)微生物絮凝劑的活性位點，反而抑制了絮凝效果[20]。

圖7 Ca2+濃度對絮凝效果的影響

3 結(jié)論

用具有絮凝活性的志賀氏菌ZF-1培養(yǎng)產(chǎn)生的絮凝劑ZF-1C進行絮凝特性的研究，改變反應(yīng)體系pH值、ZF-1C投加量、金屬離子的種類、CaCl2濃度均會影響絮凝劑的絮凝效果，得出最佳pH值為7、ZF-1最佳投加量為4 ml/L、CaCl2最佳濃度為 7 mmol/L。在實際運用中，絮凝劑投加在污水中時需要考慮絮凝劑的反應(yīng)體系環(huán)境，才能發(fā)揮絮凝劑的最佳絮凝效果。