楊杰，徐聞，孫項(xiàng)，周吟

（湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北武漢 430068）

農(nóng)業(yè)昆蟲取食農(nóng)作物，往往會造成較大經(jīng)濟(jì)損失，目前用得較多的是化學(xué)農(nóng)藥。但化學(xué)農(nóng)藥的使用對環(huán)境有危害，對人也有毒性。桿狀病毒可以作為生物農(nóng)藥使用，但是殺蟲譜比較窄。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，一種昆蟲桿狀病毒只能防控一種害蟲。農(nóng)作物常常被多種害蟲取食，導(dǎo)致普通的昆蟲病毒因?yàn)闅⑾x譜較窄，限制了實(shí)際應(yīng)用。甘藍(lán)夜蛾核型多角體病毒（MbMNPV）是一種廣譜性昆蟲病毒，能殺滅32種鱗翅目害蟲，其中包括有甘藍(lán)夜蛾、甜菜夜蛾、棉鈴蟲、小菜蛾、小地老虎、黃地老虎、粘蟲、稻縱卷葉螟和豆野螟等多種農(nóng)業(yè)重要抗性害蟲[1]。

截止目前，桿狀病毒中多個基因被認(rèn)為和病毒的宿主域相關(guān)，如已有p35、病毒DNA解旋酶p143、lef7和ie-2等[2]，其中DNA解旋酶p143基因不僅參與了DNA復(fù)制，也是最早被發(fā)現(xiàn)的與病毒宿主域相關(guān)的基因。不同桿狀病毒的宿主域并不相同，如苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒（AcMNPV）可以感染超過40種昆蟲種類，而家蠶核型多角體病毒（BmNPV）只能感染家蠶這1種宿主，當(dāng)AcMNPV中p143發(fā)生突變以后，就具有感染家蠶的能力[3]。

在MbMNPV的基因組中，除了存在解旋酶基因以外，還存在第2個拷貝的“截短版”DNA解旋酶基因（helicase 2，簡稱為hel-2），hel-2基因只在6種核型多角體病毒（NPV）中存在，但是幾乎在所有顆粒體病毒（GV）中都存在，兩個DNA解旋酶基因可能有共同的祖先，但hel-2基因序列更加保守[4]。

為了確定hel-2基因是否與病毒的宿主域相關(guān)，可以對該蛋白進(jìn)行原核表達(dá)并純化后，檢測其能否對不具有廣譜殺蟲活性的NPV起到擴(kuò)大殺蟲譜的作用。本文克隆了甘藍(lán)夜蛾核型多角體病毒hel-2基因，并在大腸桿菌中進(jìn)行了原核蛋白表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

MbMNPV由中國科學(xué)院武漢病毒研究所張忠信研究員惠贈。大腸桿菌DH5a和BL21菌種來自本實(shí)驗(yàn)室保存。DNA polymerase購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司，限制性內(nèi)切酶NotI和XhoI，T4 DNA連接酶購自 TAKARA 公司，DL2000 DNA Ladder、DL5000 DNA Ladder蛋白質(zhì) Marker、ECL Plus超敏發(fā)光液、小鼠抗His-tag抗體、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠二抗購自北京索萊寶科技有限公司，質(zhì)粒抽提試劑盒（Plasmid Mini Kit I）和膠回收純化試劑盒（Gel Extraction Kit）購自 Omega Bio-tek 公司。

1.2 方法

1.2.1 設(shè)計引物

通過堿裂解法抽提甘藍(lán)夜蛾核型多角體病毒的基因組DNA[5]，以該總DNA為模板，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中MbMNPV中helicase 2的DNA序列設(shè)計hel-2引物：上游引物為5'-AAGGAAAAAAGCGGCCGCA TGAAGCGCACTAGTGTC-3'，下游引物為5'-CCG CTCGAGTTATAACACAAGGTTGGG-3'，進(jìn)行甘藍(lán)夜蛾核型多角體病毒hel-2基因的PCR擴(kuò)增。

1.2.2 表達(dá)載體的質(zhì)粒構(gòu)建和鑒定

將pET28a和上述hel-2的PCR產(chǎn)物分別經(jīng)NotI/XhoI雙酶切，再用膠回收試劑盒進(jìn)行切膠回收，按照其說明書步驟進(jìn)行，將hel-2和pET28a膠回收產(chǎn)物在4 ℃進(jìn)行過夜酶連，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5，經(jīng)過卡那霉素平板篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子。挑取單菌落接種到液體LB培養(yǎng)基中，使用質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒，并使用NotI和XhoI進(jìn)行雙酶切，并進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測驗(yàn)證。

1.2.3 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和蛋白質(zhì)免疫印跡鑒定

將構(gòu)建成功的載體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌BL21，挑取單菌落接種到液體LB培養(yǎng)基中活化過夜，再將菌液以1∶100的濃度接種到10 mL液體LB中，37 ℃培養(yǎng)3 h，再加入異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至不同終濃度（1 mg/mL），摸索誘導(dǎo)條件，超聲破碎細(xì)菌，分別收集上清與沉淀，進(jìn)行SDSPAGE檢測，并使用His-Tag抗體，進(jìn)行免疫印跡檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET28a-hel2原核表達(dá)載體構(gòu)建

首先提取MbMNPV的基因組DNA，再以該基因組DNA為模板，使用sense和antisense引物擴(kuò)增helicase 2基因，PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA電泳檢測，結(jié)果如圖 1 所示，helicase 2 基因的長度為 1 368 bp，產(chǎn)物大小與預(yù)期一致。

圖1 hel-2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

對該P(yáng)CR產(chǎn)物和pET28a載體分別用NotI/XhoI進(jìn)行雙酶切，對酶切后的產(chǎn)物DNA凝膠電泳和切膠回收后，進(jìn)行酶連轉(zhuǎn)化，對轉(zhuǎn)化平板上的單菌落抽提質(zhì)粒，使用NotI/XhoI進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。結(jié)果如圖2所示，載體片段大小和外源目的片段大?。? 368 bp）與預(yù)期一致，表明hel-2基因片段已經(jīng)連入表達(dá)載體pET-28a，將酶連產(chǎn)物送到測序公司進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果顯示序列正確無誤。

圖2 重組質(zhì)粒pET28a-hel2質(zhì)粒酶切電泳圖譜

2.2 Hel-2蛋白誘導(dǎo)條件摸索

在誘導(dǎo)溫度37 ℃、0.4 mmol/L的IPTG濃度下，檢測了不同誘導(dǎo)時間對Hel-2蛋白表達(dá)的影響，收集IPTG誘導(dǎo)不同時間的BL21菌體，超聲破碎菌體后分別收集沉淀與上清，使用SDS-PAGE檢測，結(jié)果如圖3所示。誘導(dǎo)后1 h開始，可以在沉淀中檢測到目的蛋白表達(dá)，與預(yù)期大小一致，隨著誘導(dǎo)時間的增加，還是只能在沉淀中檢測到目的蛋白表達(dá)，而上清液中沒有檢測到目的蛋白表達(dá)。

圖3 不同誘導(dǎo)時間下Hel-2蛋白表達(dá)的SDS-PAGE圖譜

為了增加蛋白的可溶性表達(dá)，決定嘗試低溫誘導(dǎo)的方式，誘導(dǎo)溫度18 ℃，誘導(dǎo)時間為16 h，在不同IPTG濃度下進(jìn)行誘導(dǎo)，收集不同IPTG誘導(dǎo)濃度的菌體，超聲破碎菌體后分別收集沉淀與上清，使用SDSPAGE檢測，結(jié)果如圖4所示。低溫誘導(dǎo)的Hel-2蛋白還是只在沉淀里表達(dá)，在上清里面沒有檢測到目的蛋白，但與37 ℃誘導(dǎo)條件相比，沉淀中的目的蛋白生成總量有所降低。

圖4 不同IPTG濃度下Hel-2蛋白表達(dá)的SDS-PAGE圖譜

2.3 Hel-2蛋白的免疫印跡驗(yàn)證

在多種誘導(dǎo)條件下，Hel-2蛋白都以沉淀形式表達(dá)，在上清中沒有檢測到可溶性表達(dá)的蛋白，Hel-2蛋白帶有His-tag標(biāo)簽，所以采用His-tag抗體檢測了 37 ℃、0.4 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)條件下，Hel-2 融合表達(dá)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如圖5所示。上清中沒有任何信號，沉淀中能在約58 kDa處有Hel-2蛋白的表達(dá)，此外還有2個非特異性條帶。該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了SDS-PAGE的結(jié)果，Hel-2蛋白全部以包涵體的形式表達(dá)，上清中并無可溶性表達(dá)產(chǎn)物。

圖5 Hel-2蛋白的免疫印跡結(jié)果

3 結(jié)論

將甘藍(lán)夜蛾核型多角體病毒的解旋酶2進(jìn)行原核表達(dá)，結(jié)果顯示該蛋白在大腸桿菌中以包涵體的形式表達(dá)，上清液中沒有檢測到可溶性表達(dá)蛋白，這可能是解旋酶2與DNA復(fù)制過程相關(guān)，表達(dá)產(chǎn)物對細(xì)菌有毒性，因此以包涵體形式表達(dá)。未來可以通過在真核細(xì)胞內(nèi)將該蛋白表達(dá)，并進(jìn)一步探究該蛋白是否影響了病毒的廣譜殺蟲功能。