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        紅茂草揮發(fā)油干預(yù)角叉菜膠致大鼠足腫脹的代謝組學(xué)研究

        2020-07-06 09:31:24蘇鵬濤楊勸生趙強(qiáng)王順才汪霞平
        生物化工 2020年3期
        關(guān)鍵詞:角叉菜膠代謝物揮發(fā)油

        蘇鵬濤,楊勸生,趙強(qiáng),王順才,汪霞平

        (1.金昌市人民醫(yī)院,甘肅金昌 737100;2.甘肅工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,甘肅天水741025;3.天水師范學(xué)院,甘肅天水741001;4.甘肅天水岐黃藥業(yè)有限責(zé)任公司,甘肅天水 741018)

        紅茂草富含揮發(fā)油、生物堿、黃酮等多種成分, 味苦、澀,性涼,有清熱解毒、抗菌消炎、消腫止痛等功效[1-2]。用于治療動物各類創(chuàng)傷性炎癥和開放性淋巴結(jié)核、羊傳染性膿皰病、家兔皮膚毛囊炎、動物皮膚疥癬病等癥。本研究采用代謝組學(xué)方法,考察紅茂草揮發(fā)油足腫脹大鼠血漿內(nèi)源性代謝物的變化,為該藥物的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 儀器及試劑

        超高效液相色譜-高分辨飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q/TOF-MS),美國Aglient公司;CPA225D型電子天平,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;渦旋振蕩器,德國IKA公司;5920R型冷凍告訴離心機(jī),德國Eddendorf公司;KMD型調(diào)溫電熱套,山東永興儀器廠;迷你勻質(zhì)機(jī),加拿大ATS公司;揮發(fā)油提取裝置,天津市天玻玻璃儀器有限公司。

        乙腈、甲醇,色譜純,Baker公司;甲酸,分析純,Signia公司;地塞米松磷酸鈉注射液(Dex),2 mg/mL,批號1901403,山西晉新雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司;叉菜膠I型,25 g,批號C1013,Sigma公司產(chǎn)品,臨用前用新鮮的生理鹽水配制。

        1.2 試驗材料及預(yù)處理

        Wistar大鼠,購于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心,取體重200 g±20 g健康大鼠置于光照和黑暗環(huán)境(溫度22 ℃±5 ℃、濕度50%±5%)下飼養(yǎng);紅茂草揮發(fā)油,采用CO2超臨界萃取法制備[3]。

        1.3 試驗方法

        1.3.1 動物分組

        80只Wistar大鼠每天自由飲食飲水各12 h,適應(yīng)7 d,隨機(jī)分為空白對照(C)、陰性對照(NC)、給藥試驗(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)、地塞米松陽性對照(Dex)8組,每組10只,均在左后足踝關(guān)節(jié)處標(biāo)記。

        1.3.2 造模

        空白對照和陰性對照:每日1次灌胃生理鹽水(2.0 mL/kg),正常飼養(yǎng),連續(xù)灌胃7 d;給藥試驗:每日1次分別灌胃紅毛草揮發(fā)油(2.0 mL/kg、1.5 mL/kg、1.0 mL/kg、0.5 mL/kg、0.2 mL/kg)7 d,飼養(yǎng)同上;地塞米松陽性對照:同空白對照組灌胃及飼養(yǎng)6 d,第7 d時腹腔注射地塞米松(40 μg/kg)。所有大鼠在第7 d給藥后30 min,在右后足跖部皮下注射1%角叉菜膠溶液 0.1 mL 造模[4]。

        1.3.3 血漿采集與預(yù)處理

        用10%的水合氯醛溶液麻醉致炎8 h后的大鼠,采集后右足動脈血,置于盛有EDTA-K2試管中,在40 ℃條件下離心(3 000 r/min)10 min,上清液渦旋震蕩 5 s,取 100 μL 血漿樣品 8 份,分別加入 300 μL甲醇渦旋震蕩30 s,4 ℃條件靜置及離心,上清液于4 ℃存儲。

        1.3.4 色譜條件

        C18色譜柱 Phnomenx(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相組成:A為水-0.1%甲酸,B為乙腈-0.1%甲酸;柱溫 40 ℃,進(jìn)樣器溫度 4 ℃,流速 0.8 mL/min,進(jìn)樣量 10 μL。

        1.3.5 數(shù)據(jù)分析

        利用自動進(jìn)樣系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)、提取對齊UPLC-Q/TOF-MS原始數(shù)據(jù),通過XCMS軟件進(jìn)行峰提取、去噪、匹配、對齊以及數(shù)據(jù)的導(dǎo)出和保存。經(jīng)歸一化處理和修正的Excel文件導(dǎo)入SIMCA-P 11.5和SPSS 22.0軟件,結(jié)合偏最小二乘法選出P<0.05的生物性標(biāo)志物。

        1.3.6 鑒定差異代謝物

        根據(jù)保留時間(tR)和變量重要因子(VIP)質(zhì)譜信息結(jié)合京都基因與基因組百科全書(KEGG)等數(shù)據(jù)庫檢索,分辨代謝物MS譜,確定差異代謝物及含量變化。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 不同劑量紅茂草揮發(fā)油對大鼠足腫脹的影響

        分別造模后于 1 h、2 h、3 h、5 h 和 8 h 測定致腫脹的足容積,計算各大鼠致右后足跖腫脹前后容積變化值,以足腫脹度和足腫脹抑制百分率表示藥物的抗炎效果,結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明,與對照組比較,給藥試驗組組均有顯著的抑制大鼠角叉菜膠性足腫脹的作用(P<0.05)。

        2.2 差異代謝產(chǎn)物

        2.2.1 建立血漿樣本代謝物分析多變量數(shù)據(jù)

        采用UPLC-Q/TOF-MS對血漿樣本分析紅毛草揮發(fā)油干預(yù)角叉菜膠致大鼠足腫脹的效果,在正負(fù)離子模式下分析見圖1和圖2??梢钥闯鲈谡?fù)離子模式下,8組血漿樣本中空白組、陰性對照組、試驗組及地塞米松陽性組相互分離明顯,試驗組中紅茂草揮發(fā)油劑量的增加呈現(xiàn)向空白組和地塞米松陽性對照組靠近的趨勢,說明給予不同量的紅茂草揮發(fā)油,均對炎癥大鼠異常的生理及物質(zhì)代謝有明顯的調(diào)節(jié)作用,且劑量越大效果越明顯。

        表1 各組大鼠不同時點抗角叉菜膠所致足腫脹度比較

        圖1 正離子模式下8組大鼠的血漿分析結(jié)果

        圖2 負(fù)離子模式下8組大鼠的血漿分析結(jié)果

        2.2.2 鑒定差異代謝產(chǎn)物

        根據(jù)保留時間(tR)和變量重要因子(VIP)質(zhì)譜信息,通過篩選、查詢,并與京都基因與基因組百科全書(KEGG)等數(shù)據(jù)庫比較,鑒定出在正負(fù)離子模式下血漿樣品中12個潛在的差異代謝物,結(jié)果見表2所示。

        表2 血漿中差異代謝物序號

        可見,血漿樣品中分離出12個潛在的差異代謝物,與空白對照組比較,正離子模式下陰性對照組大鼠血漿中芳樟醇、小茴香醇、3,5-二乙基甲苯、香葉醇、橙花醇和3,5-二乙基甲苯含量明顯高于空白組(P<0.05);負(fù)離子模式下陰性對照組大鼠血漿中1,3-二甲基萘、1-十六碳烯-1-醇乙酸乙酯、3,4-二甲基-3-環(huán)己烯-1-甲醛、壬酸、2-乙烯基萘和肉桂醛含量明顯低于空白組(P<0.05)。試驗組中的這些標(biāo)志物含量均向空白組和地塞米松陽性對照組回歸,說明給予不同量的紅茂草揮發(fā)油均對角叉菜膠致足炎癥大鼠異常的生理及物質(zhì)代謝有明顯的調(diào)節(jié)作用。

        3 結(jié)論

        通過代謝組學(xué)方法研究紅茂草揮發(fā)油抗大鼠足腫脹炎癥作用機(jī)制,顯示不同劑量的紅茂草揮發(fā)油均可抑制大鼠角叉菜膠性足腫脹,調(diào)節(jié)炎癥大鼠異常的生理及物質(zhì)代謝,劑量越大作用效果越明顯。以血漿樣本分析尋找出內(nèi)源性代謝產(chǎn)物,比較藥物作用于模型大鼠靶器官或組織前后內(nèi)源性小分子代謝物(數(shù)量、種類)的變化,篩選比對鑒定出12種差異代謝物。研究表明,紅茂草揮發(fā)油主要是通過調(diào)節(jié)血漿物質(zhì)的代謝發(fā)揮抗炎作用,揭示藥物與機(jī)體間的相互作用機(jī)制,為新藥研發(fā)提供參考。

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