蘇鵬濤，楊勸生，趙強(qiáng)，王順才，汪霞平

（1.金昌市人民醫(yī)院，甘肅金昌 737100；2.甘肅工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅天水741025；3.天水師范學(xué)院，甘肅天水741001；4.甘肅天水岐黃藥業(yè)有限責(zé)任公司，甘肅天水 741018）

紅茂草富含揮發(fā)油、生物堿、黃酮等多種成分， 味苦、澀，性涼，有清熱解毒、抗菌消炎、消腫止痛等功效[1-2]。用于治療動(dòng)物各類(lèi)創(chuàng)傷性炎癥和開(kāi)放性淋巴結(jié)核、羊傳染性膿皰病、家兔皮膚毛囊炎、動(dòng)物皮膚疥癬病等癥。本研究采用代謝組學(xué)方法，考察紅茂草揮發(fā)油足腫脹大鼠血漿內(nèi)源性代謝物的變化，為該藥物的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

超高效液相色譜-高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q/TOF-MS），美國(guó)Aglient公司；CPA225D型電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；渦旋振蕩器，德國(guó)IKA公司；5920R型冷凍告訴離心機(jī)，德國(guó)Eddendorf公司；KMD型調(diào)溫電熱套，山東永興儀器廠；迷你勻質(zhì)機(jī)，加拿大ATS公司；揮發(fā)油提取裝置，天津市天玻玻璃儀器有限公司。

乙腈、甲醇，色譜純，Baker公司；甲酸，分析純，Signia公司；地塞米松磷酸鈉注射液（Dex），2 mg/mL，批號(hào)1901403，山西晉新雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司；叉菜膠I型，25 g，批號(hào)C1013，Sigma公司產(chǎn)品，臨用前用新鮮的生理鹽水配制。

1.2 試驗(yàn)材料及預(yù)處理

Wistar大鼠，購(gòu)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，取體重200 g±20 g健康大鼠置于光照和黑暗環(huán)境（溫度22 ℃±5 ℃、濕度50%±5%）下飼養(yǎng)；紅茂草揮發(fā)油，采用CO2超臨界萃取法制備[3]。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組

80只Wistar大鼠每天自由飲食飲水各12 h，適應(yīng)7 d，隨機(jī)分為空白對(duì)照（C）、陰性對(duì)照（NC）、給藥試驗(yàn)（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ）、地塞米松陽(yáng)性對(duì)照（Dex）8組，每組10只，均在左后足踝關(guān)節(jié)處標(biāo)記。

1.3.2 造模

空白對(duì)照和陰性對(duì)照：每日1次灌胃生理鹽水（2.0 mL/kg），正常飼養(yǎng)，連續(xù)灌胃7 d；給藥試驗(yàn)：每日1次分別灌胃紅毛草揮發(fā)油（2.0 mL/kg、1.5 mL/kg、1.0 mL/kg、0.5 mL/kg、0.2 mL/kg）7 d，飼養(yǎng)同上；地塞米松陽(yáng)性對(duì)照：同空白對(duì)照組灌胃及飼養(yǎng)6 d，第7 d時(shí)腹腔注射地塞米松（40 μg/kg）。所有大鼠在第7 d給藥后30 min，在右后足跖部皮下注射1%角叉菜膠溶液 0.1 mL 造模[4]。

1.3.3 血漿采集與預(yù)處理

用10%的水合氯醛溶液麻醉致炎8 h后的大鼠，采集后右足動(dòng)脈血，置于盛有EDTA-K2試管中，在40 ℃條件下離心（3 000 r/min）10 min，上清液渦旋震蕩 5 s，取 100 μL 血漿樣品 8 份，分別加入 300 μL甲醇渦旋震蕩30 s，4 ℃條件靜置及離心，上清液于4 ℃存儲(chǔ)。

1.3.4 色譜條件

C18色譜柱 Phnomenx（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相組成：A為水-0.1%甲酸，B為乙腈-0.1%甲酸；柱溫 40 ℃，進(jìn)樣器溫度 4 ℃，流速 0.8 mL/min，進(jìn)樣量 10 μL。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

利用自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)、提取對(duì)齊UPLC-Q/TOF-MS原始數(shù)據(jù)，通過(guò)XCMS軟件進(jìn)行峰提取、去噪、匹配、對(duì)齊以及數(shù)據(jù)的導(dǎo)出和保存。經(jīng)歸一化處理和修正的Excel文件導(dǎo)入SIMCA-P 11.5和SPSS 22.0軟件，結(jié)合偏最小二乘法選出P＜0.05的生物性標(biāo)志物。

1.3.6 鑒定差異代謝物

根據(jù)保留時(shí)間（tR）和變量重要因子（VIP）質(zhì)譜信息結(jié)合京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）等數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，分辨代謝物MS譜，確定差異代謝物及含量變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量紅茂草揮發(fā)油對(duì)大鼠足腫脹的影響

分別造模后于 1 h、2 h、3 h、5 h 和 8 h 測(cè)定致腫脹的足容積，計(jì)算各大鼠致右后足跖腫脹前后容積變化值，以足腫脹度和足腫脹抑制百分率表示藥物的抗炎效果，結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，給藥試驗(yàn)組組均有顯著的抑制大鼠角叉菜膠性足腫脹的作用（P＜0.05）。

2.2 差異代謝產(chǎn)物

2.2.1 建立血漿樣本代謝物分析多變量數(shù)據(jù)

采用UPLC-Q/TOF-MS對(duì)血漿樣本分析紅毛草揮發(fā)油干預(yù)角叉菜膠致大鼠足腫脹的效果，在正負(fù)離子模式下分析見(jiàn)圖1和圖2?？梢钥闯鲈谡?fù)離子模式下，8組血漿樣本中空白組、陰性對(duì)照組、試驗(yàn)組及地塞米松陽(yáng)性組相互分離明顯，試驗(yàn)組中紅茂草揮發(fā)油劑量的增加呈現(xiàn)向空白組和地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組靠近的趨勢(shì)，說(shuō)明給予不同量的紅茂草揮發(fā)油，均對(duì)炎癥大鼠異常的生理及物質(zhì)代謝有明顯的調(diào)節(jié)作用，且劑量越大效果越明顯。

表1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)抗角叉菜膠所致足腫脹度比較

圖1 正離子模式下8組大鼠的血漿分析結(jié)果

圖2 負(fù)離子模式下8組大鼠的血漿分析結(jié)果

2.2.2 鑒定差異代謝產(chǎn)物

根據(jù)保留時(shí)間（tR）和變量重要因子（VIP）質(zhì)譜信息，通過(guò)篩選、查詢(xún)，并與京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）等數(shù)據(jù)庫(kù)比較，鑒定出在正負(fù)離子模式下血漿樣品中12個(gè)潛在的差異代謝物，結(jié)果見(jiàn)表2所示。

表2 血漿中差異代謝物序號(hào)

可見(jiàn)，血漿樣品中分離出12個(gè)潛在的差異代謝物，與空白對(duì)照組比較，正離子模式下陰性對(duì)照組大鼠血漿中芳樟醇、小茴香醇、3,5-二乙基甲苯、香葉醇、橙花醇和3,5-二乙基甲苯含量明顯高于空白組（P＜0.05）；負(fù)離子模式下陰性對(duì)照組大鼠血漿中1,3-二甲基萘、1-十六碳烯-1-醇乙酸乙酯、3,4-二甲基-3-環(huán)己烯-1-甲醛、壬酸、2-乙烯基萘和肉桂醛含量明顯低于空白組（P＜0.05）。試驗(yàn)組中的這些標(biāo)志物含量均向空白組和地塞米松陽(yáng)性對(duì)照組回歸，說(shuō)明給予不同量的紅茂草揮發(fā)油均對(duì)角叉菜膠致足炎癥大鼠異常的生理及物質(zhì)代謝有明顯的調(diào)節(jié)作用。

3 結(jié)論

通過(guò)代謝組學(xué)方法研究紅茂草揮發(fā)油抗大鼠足腫脹炎癥作用機(jī)制，顯示不同劑量的紅茂草揮發(fā)油均可抑制大鼠角叉菜膠性足腫脹，調(diào)節(jié)炎癥大鼠異常的生理及物質(zhì)代謝，劑量越大作用效果越明顯。以血漿樣本分析尋找出內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，比較藥物作用于模型大鼠靶器官或組織前后內(nèi)源性小分子代謝物（數(shù)量、種類(lèi)）的變化，篩選比對(duì)鑒定出12種差異代謝物。研究表明，紅茂草揮發(fā)油主要是通過(guò)調(diào)節(jié)血漿物質(zhì)的代謝發(fā)揮抗炎作用，揭示藥物與機(jī)體間的相互作用機(jī)制，為新藥研發(fā)提供參考。