朱美旗，劉雪懿，錢文強(qiáng)，張立翱，楊陽

（西安醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710000）

三七（Panax notoginseng (Burk.)F.H.Chen）為五加科（Araliaceae）植物，藥用部位為干燥根，是一種具有止血、祛瘀、消腫、止痛功能的傳統(tǒng)中藥。其主要有效成分為達(dá)瑪脂烷系皂苷，具有擴(kuò)張血管、增加冠狀動脈血流量、降低血脂及膽固醇的作用，并對治療冠心病和心絞痛有顯著療效[1]。中藥生產(chǎn)過程中，活性成分提取步驟尤為關(guān)鍵，有效提取活性成分直接關(guān)系到中藥生產(chǎn)的成本和經(jīng)濟(jì)效益[2]。一個(gè)好的提取工藝需要高提取效率[3]。因此，對4種不同的提取工藝進(jìn)行比對，優(yōu)選出最佳提取方法，為研究三七有效成分提取分離提供借鑒依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

藥材為三七粉末，對照品為人參皂苷Rg1（上海源葉生物科技有限公司，B21057-20mg BZO，CAS#22427-39-0 HPLC ≥ 98%，儲存條件 2～8 ℃），檸檬酸（0.1 mol/L）-磷酸氫二鈉（0.2 mol/L）緩沖液，纖維素酶（28.6 U/g），香草醛-冰醋酸溶液（分析純），高氯酸溶液（分析純），甲醇（分析純），無水乙醇（分析純）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器，北京海天友誠科技有限公司；7200型紫外分光光度計(jì)，北京京科瑞達(dá)科技有限公司；恒溫水浴鍋，濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司。

1.3 對照品溶液制備

將97.7%對照品人參皂苷Rg1置干燥器中12 h，稱取20 mg放入50 mL容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻[4]，即得到 0.3 908 mg/mL 對照品溶液。

1.4 人參皂苷Rg1的檢測

吸取一定量的待測溶液，置于10 mL帶塞試管中，放入80 ℃水浴鍋，水浴揮干溶劑。再分別加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，60 ℃水浴15 min，立即放入冰水中進(jìn)行冷卻。冷卻后加入 5.0 mL 冰醋酸，搖勻，放置 15 min[4]后于 529 nm處進(jìn)行測定。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法[4-5]，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并求得回歸方程為C=3.203 4A+0.088（R2=0.998 1）。

1.6 三七中人參皂苷Rg1的提取

1.6.1 酶解加超聲提取法

取5 g三七粉末置于圓底燒瓶中，用40 mL蒸餾水浸泡30 min，加入檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液調(diào)節(jié)pH至5，再加纖維素酶143 U置55 ℃水浴鍋中，水浴28 min，期間適量攪拌，酶解后加入乙醇[6]，在數(shù)控超聲波清洗器中進(jìn)行提取[5]，過濾，將濾渣加乙醇再次進(jìn)行提取，混合兩次提取液。提取液經(jīng)顯色反應(yīng)后，測量吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求濃度，根據(jù)提取液體積，計(jì)算含量。

分別考察50%乙醇體積、濃度、超聲提取溫度及超聲提取時(shí)間4個(gè)因素對三七人參皂苷Rg1提取含量的影響。并在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選用L9（34）進(jìn)行酶解加超聲法正交實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.6.2 超聲提取法

稱取5 g三七粉末，置于50 mL容量瓶中，用規(guī)定體積分?jǐn)?shù)的乙醇浸潤，然后乙醇定容，進(jìn)行超聲提取，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)取出容量瓶，靜置備用。顯色后在529 nm處測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求濃度，根據(jù)提取液體積，計(jì)算含量。分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲功率及超聲提取時(shí)間4個(gè)因素對三七人參皂苷Rg1提取含量的影響，并在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選用L9（34）進(jìn)行超聲法正交實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.6.3 乙醇回流提取法

取5 g三七粉末，加入乙醇回流提取，即得三七提取液。精密吸取三七提取液5.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容、搖勻、濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。取供試液5.0 mL于蒸發(fā)皿中，揮干溶劑，進(jìn)行顯色反應(yīng)后，在529 nm處測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求濃度，根據(jù)提取液體積，計(jì)算含量。

分別考察乙醇濃度、乙醇體積、回流時(shí)間及提取次數(shù)4個(gè)因素對三七人參皂苷Rg1提取含量的影響，并在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選用L9（34）進(jìn)行乙醇回流提取法正交實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.6.4 酶解加乙醇回流法

取三七粉末5 g，置燒杯中，加入40 mL蒸餾水浸泡30 min。取預(yù)處理過的三七液，置于圓底燒瓶中，加適量的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，放置2 min，將pH調(diào)至5.0，并在55℃水浴中加入適量的纖維素酶（28.6 U/g）恒溫，在此期間適時(shí)攪拌,水浴2h，酶解后加入乙醇回流提取[6-7]，得到三七提取液，精密吸取2.0 mL三七提取液，置于 10.0 mL容量瓶中，甲醇（99.5%）定容。再取待測溶液5.0 mL于蒸發(fā)皿中，揮干溶劑，進(jìn)行顯色反應(yīng)后，在529 nm處測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求濃度，根據(jù)提取液體積計(jì)算含量。

分別考察提取次數(shù)、提取時(shí)間、乙醇濃度及料液比4個(gè)因素對三七人參皂苷Rg1提取含量的影響，并在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選用L9（34）進(jìn)行酶解加乙醇回流提取法正交實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解加超聲提取法

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)

如圖1所示，（1）采用不同體積的60%乙醇在50 ℃條件下分別超聲提取 50 min[8]，乙醇體積為 60 mL時(shí)，人參皂苷Rg1得率最高；（2）在乙醇量80 mL，超聲提取時(shí)間50 min、超聲溫度50 ℃的條件下分別采用5種不同濃度的乙醇進(jìn)行提取[9]，發(fā)現(xiàn)乙醇濃度在70%時(shí)，人參皂苷Rg1收率最大；（2）在乙醇量80 mL，乙醇濃度60%、超聲溫度50 ℃的條件下，分別在不同提取時(shí)間下提取三七人參皂苷Rg1[9]，發(fā)現(xiàn)當(dāng)提取時(shí)間為70 min時(shí)，三七人參皂苷Rg1的收率最大；（3）在乙醇量80 mL，乙醇濃度60%、超聲時(shí)間50 min的條件下，測定不同提取溫度下人參皂苷Rg1的得率[10]，發(fā)現(xiàn)提取溫度為50 ℃時(shí)，收率最高。

2.1.2 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選用表1中的正交實(shí)驗(yàn)因素設(shè)計(jì)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)。表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇體積對人參皂苷Rg1收率影響最大，其次是提取溫度、乙醇濃度、提取時(shí)間；通過實(shí)驗(yàn)可得，最大收率在工藝A1B3C3D3時(shí)出現(xiàn)，收率為0.276%，與由k值得到最優(yōu)組合結(jié)果一致。

2.1.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

在最佳提取工藝條件下，即用40 mL 80%的乙醇在60 ℃條件下提取70 min,進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，求得平均收率為0.2807%。

2.2 超聲提取法

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

如圖2所示，在料液比1∶10（g/mL）、超聲提取時(shí)間60 min、功率50 kHz的條件下分別用5組不同乙醇濃度進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)，三七人參皂苷Rg1收率最大；在70%乙醇、提取時(shí)間60 min、提取功率50 kHz的條件下分別用5組不同料液比進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)料液比為1∶12時(shí)三七人參皂苷Rg1收率最大；在料液比1∶10、乙醇濃度70%、提取時(shí)間60 min的條件下分別用5組不同超聲功率進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)當(dāng)提取功率為60 kHz時(shí)三七人參皂苷Rg1 收率最大；在超聲功率50 kHz、料液比1∶10、70%乙醇的條件下分別用5組不同提取時(shí)間進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)當(dāng)提取時(shí)間為60 min時(shí)，三七人參皂苷Rg1收率最高。

圖1 酶解加超聲提取法得率單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.2 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選用表3中的正交實(shí)驗(yàn)因素設(shè)計(jì)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)表（表4）進(jìn)行超聲提取法正交實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇濃度對人參皂苷Rg1收率影響最大，其次是料液比、提取時(shí)間、超聲功率；實(shí)驗(yàn)中最大收率在組合A1B2C2D2時(shí)出現(xiàn)，收率為1.548%，而最優(yōu)組合為A2B2C3D2，不在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，因此需進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在最佳提取工藝條件下，即用70%乙醇，以1∶12的料液比，在超聲功率60 kHz下提取60 min，進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，求得平均收率為1.682%。

2.3 乙醇回流提取法

2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

如圖3所示，取5份5 g三七粉末，分別加入不同濃度的乙醇進(jìn)行回流提取，發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙醇濃度為45%時(shí)，三七人參皂苷Rg1收率最高；取5份5 g三七粉末，分別加入不同體積的適宜濃度乙醇進(jìn)行回流提取，發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙醇體積為50 mL時(shí)，三七人參皂苷Rg1收率最高；取 5份 5 g三七粉末，用 50 mL 45% 乙醇在不同的回流時(shí)間下進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)當(dāng)回流時(shí)間為1 h時(shí)，三七人參皂苷Rg1收率最高；取5份5 g三七粉末，用50 mL 45%乙醇以不同次數(shù)進(jìn)行回流提取，發(fā)現(xiàn)當(dāng)提取次數(shù)為3次時(shí)，三七人參皂苷Rg1收率最高。

表3 超聲提取法因素水平表

表4 超聲提取法正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果

2.3.2 正交實(shí)驗(yàn)

圖2 超聲提取法得率單因素實(shí)驗(yàn)

圖3 乙醇回流提取法得率單因素實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選用表5中的正交實(shí)驗(yàn)因素設(shè)計(jì)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)。表6實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示各因素影響的程度依次為提取時(shí)間＞提取次數(shù)＞乙醇量＞乙醇濃度，實(shí)驗(yàn)中最大收率在組合A1B2C2D2時(shí)出現(xiàn)，收率為1.570%，而最優(yōu)組合為A1B2C3D2，因此需要進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

表5 乙醇回流提取工藝因素水平

表6 乙醇回流法正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果

2.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在最佳提取工藝條件下，即用45%乙醇50 mL，提取3次，每次時(shí)間為90 min，進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，所得平均收率為1.613%。

2.4 酶解加乙醇回流法

2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

如圖4所示，取酶解后的三七，按料液比1:8加入80%乙醇，以不同提取次數(shù)進(jìn)行回流提取，每次回流2 h[7]，發(fā)現(xiàn)當(dāng)提取次數(shù)為4次時(shí)，三七人參皂苷Rg1收率最高；取酶解后的三七，按料液比1:8加入80%乙醇以不同回流時(shí)間進(jìn)行提取[8]，發(fā)現(xiàn)當(dāng)回流時(shí)間為2 h時(shí)，三七人參皂苷Rg1收率最高；取經(jīng)過酶解后的三七，以不同濃度的乙醇進(jìn)行回流提取2 h[7-8]，發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙醇濃度為85%和95%時(shí)，三七人參皂苷Rg1收率最高；取經(jīng)過酶解后的三七，以不同料液比進(jìn)行回流提取2 h[7]，發(fā)現(xiàn)當(dāng)料液比為1:12和1:14時(shí)，三七人參皂苷Rg1收率最高。

2.4.2 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選用表7中的正交實(shí)驗(yàn)因素設(shè)計(jì)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)。由表8實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，各因素影響程度依次為乙醇濃度＞提取次數(shù)＞料液比＞提取時(shí)間，最大收率在工藝A2B2C3D1時(shí)出現(xiàn)，與由k值得到最優(yōu)組合結(jié)果一致。

2.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

圖4 酶解加乙醇回流法得率單因素實(shí)驗(yàn)

表7 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表8 酶解加乙醇回流法正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果

按最優(yōu)工藝參數(shù)，即使用10倍量85%乙醇，提取4次，每次回流1.5 h，重復(fù)試驗(yàn)3次，所得平均收率為2.505%。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，四個(gè)方法的收率大小順序?yàn)槊附饧右掖蓟亓鞣ǎ境曁崛》ǎ疽掖蓟亓鞣ǎ久附饧映曁崛》?，即采用酶解加乙醇回流法提取三七中的人參皂苷Rg1所得收率最高。該方法中，影響收率的因素大小為乙醇濃度＞提取次數(shù)＞加醇量倍數(shù)＞提取時(shí)間，根據(jù)實(shí)驗(yàn)已優(yōu)選出最佳的提取條件，即先在55℃水浴鍋中用適量28.6 U/g的纖維素酶水解2h，再將酶解后的三七按料液比1∶10（g/mL）加入85%乙醇提取4次，每次回流1.5 h。