李鵑，蔡潔行，張崢，朱煥章

（1.復(fù)旦大學(xué)，上海 200433；2.上海藥明生物技術(shù)有限公司，上海 200131）

隨著生物制藥行業(yè)的蓬勃發(fā)展，CHO細胞蛋白生產(chǎn)的需求日益增加[1]。細胞群批次補料可以在較短時間內(nèi)提供克級以上蛋白用于研發(fā)等用途，因此其應(yīng)用越來越廣泛[2]。批次補料過程中，各種代謝廢物也在培養(yǎng)體系中不斷堆積，造成細胞周圍環(huán)境逐漸惡化[3-5]，細胞活率降低，從而影響蛋白最終產(chǎn)量。

本研究針對丙酮酸脫氫酶激酶3（PDHK3）設(shè)計3組特定的shRNA（PDHK3-1、PDHK3-2、PDHK3-3），并將其分別克隆至WuXi Biologics載體中。為加強shRNA的抑制效果，將設(shè)計的3組shRNA以1∶1∶1進行混合，在CHO細胞群構(gòu)建時將含有這些混合質(zhì)粒與待表達蛋白的質(zhì)粒一同轉(zhuǎn)染進入宿主細胞中。在批次補料實驗中發(fā)現(xiàn)，通過轉(zhuǎn)染8組不同的蛋白分子，批次補料過程中每一組的乳酸含量均得到明顯降低，同時蛋白表達量得到顯著提高。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑、試劑盒與儀器

shRNA質(zhì)粒提取使用試劑盒（MACHEREYNAGEL）；PDHK3基因mRNA水平檢測使用RTPCR試劑盒（Invitrogen）及PCR試劑盒（TaKaRa）；轉(zhuǎn)染過程使用電轉(zhuǎn)試劑（Lonza）。

Vicell細胞計數(shù)儀（Beckman，XR）、細胞培養(yǎng)生化分析儀（NoVa，F(xiàn)LEX）、高效液相色譜（HPLC）（Agilent，1260 Infinity Ⅱ）

1.1.2 質(zhì)粒、菌株與宿主細胞

質(zhì)粒、菌株、細胞系等宿主細胞CHOK1、WuXi Bio表達載體和感受態(tài)TOP10為WuXi Biologics平臺所有，PDHK3-shRNA及shRNA陰性對照的目的基因合成由蘇州金唯智生物科技有限公司完成，含有PDHK3-shRNA或者shRNA陰性對照的目的基因由蘇州金唯智生物科技有限公司克隆至WuXiBio表達載體，完成重組菌株的制備。

1.1.3 引物與探針

1.1.3.1 PDHK3基因的mRNA水平檢測

正向引物：TGGCGAACACAATGAGAGAAGT；反向引物：TGCATGTACCAACTCTGAACTAATCC；探針：AATCTTTTGCCGGATAAC。

1.1.3.2 neomycin基因拷貝數(shù)檢測

正向引物：TGCCGAATATCATGGTGGAA；反向引物：GCCAAGCTCTTCAGCAATATCA；探針：TGGCCGCTTTTCT。

1.2 方法

1.2.1 shRNA質(zhì)粒的構(gòu)建

選取PDHK3的3個目的區(qū)域：5’-GGACTTCGGAAGAGATAATGC-3’（ORF 327～347）；5’-GCTACTCTGTGAACAGTATTA-3’（ORF 843～863）；5’-GCCCTTTCAAGTGAATCATTT-3’（ORF1306～1326）。

含有PDHK3基因的shRNA質(zhì)粒設(shè)計為含有反向互補的目的基因序列，中間由一莖環(huán)（TTGATATCC）序列分割，組成短發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

同時設(shè)計含有陰性對照shRNA的質(zhì)粒：GTCGC TTACCGATTCAGAATGGTTGATATCCGCCATTCTGA ATCGGTAAGCGAC。

合成以上基因序列，分別添加 5’（BamHI）、3’UTR（[ACATTGATTATTG]）和 3’（SpeI），將基因通過 5’BamHI和 3’SpeI克隆至載體 WuXi Bio 表達載體（Ampicillin），制備重組質(zhì)粒DNA及重組菌株。

1.2.2 宿主CHOK1細胞培養(yǎng)

宿主CHOK1細胞使用搖瓶在CD CHO培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，每隔3～4 d進行傳代，搖床培養(yǎng)條件為溫度36.5 ℃，二氧化碳濃度6.0%。

1.2.3 轉(zhuǎn)染CHO細胞并進行加壓篩選構(gòu)建細胞系

使用電轉(zhuǎn)試劑（Lonza）進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染條件設(shè)置見表1。

表1 轉(zhuǎn)染條件設(shè)置

單獨轉(zhuǎn)染含有表達目的蛋白質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)含有針對PDHK3-shRNA（1+2+3）的混合質(zhì)粒和含有表達目的蛋白質(zhì)粒，單獨轉(zhuǎn)染含有陰性對照shRNA的質(zhì)粒3種條件，8個蛋白分子共轉(zhuǎn)染24個細胞系。其中PDHK3-shRNA混合質(zhì)粒中3個shRNA的比例為1∶1∶1。

轉(zhuǎn)染24 h后，通過加入含有相應(yīng)抗生素的篩選培養(yǎng)基進行CHO細胞篩選，每隔2～4 d以0.7×105～3.0×105cells/mL 的密度進行傳代。經(jīng)過2～3周傳代，細胞活率恢復(fù)到95%以上，篩選出能夠表達目的蛋白及shRNA-PDHK3的細胞系。

1.2.4 批次補料實驗及乳酸含量、抗體蛋白表達量檢測

篩選結(jié)束后，以3～7 E5密度接種搖管批次補料實驗，接種后根據(jù)細胞生長進行多次補料。Vicell細胞計數(shù)儀檢測細胞活率、細胞密度，NoVa儀直接檢測上清液中乳酸含量。第14 d收獲上清樣品，使用HPLC檢測各個抗體蛋白分子目的蛋白的表達量。

1.2.5 PDHK3基因mRNA水平檢測

收集批次補料細胞沉淀，提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。針對載體PDHK3基因區(qū)域設(shè)計引物和探針，利用qPCR方法檢測PDHK3的mRNA水平。宿主CHO細胞的B2M為內(nèi)參基因，PDHK3與B2M檢測值的比值即可反映轉(zhuǎn)入shRNA-PDHK3的細胞PDHK3基因的mRNA水平的變化趨勢。

1.2.6 Neomycin基因拷貝數(shù)檢測

收集批次補料第0 d細胞沉淀以及批次補料過程第10 d的細胞沉淀，分別提取每個樣品的基因組DNA。針對載體Neomycin基因區(qū)域設(shè)計特定的引物和探針，利用ddPCR技術(shù)定量檢測Neomycin基因拷貝數(shù)，通過該基因的拷貝數(shù)間接反應(yīng)PDHK3-shRNA的基因拷貝數(shù)情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 批次補料抗體蛋白表達量

在14 d左右的搖管批次補料實驗中，于批次補料結(jié)束后收集上清液進行HPLC_ProteinA檢測蛋白表達量。實驗結(jié)果顯示共轉(zhuǎn)了PDHK3-shRNA的條件，第14 d的蛋白表達量提高了18.6%～233%，見圖1。表明抑制PDHK2基因，可以有效提高抗體蛋白表達量。

2.2 批次補料過程乳酸表達量

批次補料過程中，收集上清檢測乳酸含量的變化。實驗組的乳酸表達量在第5～14 d表現(xiàn)出較大差別，乳酸含量在批次補料過程中不斷降低，而對照組乳酸含量不斷增加（除第5個分子），見圖2。

2.3 PDHK3基因的mRNA表達水平

選取兩個比較有代表性的蛋白分子進行PDHK3基因的mRNA表達水平檢測。其中分子5是批次補料過程中唯一一個乳酸含量變化較小的分子，實驗組乳酸堆積雖然相對對照組后期的乳酸較低，但并未隨著時間的推移而逐漸降低。該分子的實驗組相對于對照組的PDHK3基因的mRNA表達水平降低了76%。分子7蛋白表達水平提高了233%，是蛋白表達提高百分比最高的分子。該分子的實驗組相對于對照組的PDHK3基因的mRNA表達水平降低了65%。通過實驗可知，抑制PDHK3基因的mRNA表達可以降低乳酸表達，同時可以提高目的蛋白產(chǎn)量。

2.4 Neomycin基因拷貝數(shù)檢測

4個分子（mAb1～mAb4）的實驗組和對照組2轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒中均含有Neomycin基因，拷貝數(shù)為4～9，見圖4。由拷貝數(shù)檢測實驗可知，PDHK3-shRNA在轉(zhuǎn)染過程及批次補料過程均有基因表達。

圖1 抗體相對表達量

圖2 乳酸表達量曲線

圖3 PDHK3基因的mRNA相對表達水平

圖4 Neomycin基因拷貝數(shù)

3 結(jié)論

將3個PDHK3-shRNA分別構(gòu)建到WuXiBio載體中，這些混合質(zhì)粒與表達不同蛋白的質(zhì)粒分別共同轉(zhuǎn)染至宿主CHO細胞中。通過對Neomycin基因拷貝數(shù)檢測結(jié)果表明，構(gòu)建的PDHK3-shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染并整合到CHO細胞的基因組DNA中。而PDHK3基因的mRNA水平顯著降低且批次補料過程中乳酸含量降低，說明抑制PDHK3基因的表達可以降低乳酸含量。同時8個mAb實驗組的蛋白產(chǎn)量均得到提高，推測是由于細胞生長環(huán)境如pH得到改善，更有利于細胞表達目的蛋白。

綜上所述，本研究證明通過利用shRNA方法抑制PDHK3基因的表達，不僅可以降低乳酸表達量，同時能夠提高目的蛋白的表達量。