尹海夢，王丹，林輝煥，季金茍*，郝石磊

（1.重慶大學 化學化工學院制藥工程系，重慶 401331；2.重慶大學 生物工程學院，重慶 400030）

口服結腸定位給藥系統是一種通過制劑學手段使藥物在上消化道保持完整，達到結腸部位才發(fā)揮作用的給藥系統，是目前制劑領域的研究熱點之一[1-2]。吲哚美辛（Indomethacin，IDM）是一種非甾體類抗炎藥，具有解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎作用，同時具有抗結腸癌的作用[3-4]。但IDM幾乎不溶于水，因而具有口服吸收不好、生物利用度低和胃腸道不良反應大等問題[5-6]。

β-環(huán)糊精（β-Cyclodextrin，β-CD）是一類環(huán)狀寡糖，具有疏水性內部空腔和親水性外部結構，這一獨特結構允許疏水分子或疏水部分通過非共價鍵被包合進空腔以此來形成水溶性包合物，從而起到增溶、緩釋和增加穩(wěn)定性的作用[7]。尤特奇S100（Eudragit S100，ES100）為甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯（1︰2）共聚物，在pH＞7的介質中溶解，是理想的pH依賴性聚合物之一[8]，因而具有pH觸發(fā)的胃腸道靶向性。納米制劑由于其納米效應，對腫瘤或炎性組織具有被動靶向性[9]，因而能增加腫瘤部位或炎性部位的局部藥物濃度。另外，納米顆粒還具有增加藥物穩(wěn)定性，減少藥物毒副作用的功能[10-11]。本文為了增加IDM的水溶性，同時減少其對胃腸道的毒副作用，利用β-CD為載體，包合IDM，并外包腸溶性ES100，制備成納米制劑，以期為腸腫瘤或腸炎設計出更為理想的新劑型。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

1.1.1 儀器

Nano ZS90 Zetasizer激 光 粒 度 測 定 儀（Laser particle size analyzer，LPSA），英國馬爾文公司；T6新世紀紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；TG-16高速離心機，鞏義市裕華儀器廠；FD-1冷凍干燥機，北京德天佑科技發(fā)展有限公司；HJ-4A調速磁力攪拌器，鞏義市裕華儀器廠；JSM-7800F掃描電子顯微鏡（SEM），日本日立制作所；XRD 6000 X-射線衍射光譜分析儀（X-ray diffractometer，XRD），日本島津制作所。

1.1.2 試劑

IDM，上海阿達瑪斯有限公司；β-CD，重慶川東化工集團有限公司；ES100，德國羅姆公司；乙醇，重慶川東化工集團有限公司；鹽酸，重慶川東化工集團有限公司；液體石蠟，成都科龍化工試劑廠；Span80，成都科龍化工試劑廠；磷酸二氫鈉，醫(yī)藥集團化學試劑有限司；磷酸氫二鈉，醫(yī)藥集團化學試劑有限公司；蒸餾水。本實驗所用試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制

稱取適量IDM，溶解于pH 7.8的磷酸鹽緩沖液（PBS）中配制成一系列不同濃度的溶液，用紫外可見分光光度計在320 nm處測定吸光度（A），并繪制IDM在pH 7.8的PBS中的標準曲線。

1.2.2 β-CD的相溶解度

相溶解度實驗采用Higuchi和Connors報導的方法[12]進行，稱取不同量的β-CD溶解于30 mL乙醇水溶液（乙醇︰水=3︰2）中，再分別加入過量的IDM，并稱重，記為m。將上述體系置于50 ℃水浴中，恒溫攪拌，使溶液中的乙醇揮發(fā)，每隔1 h稱重，并補入相應的蒸餾水維持體系的質量為m，反應12 h。抽濾，收集上清液，用磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉調pH至7.8，用紫外可見分光光度計在320 nm處測得A，通過標準曲線計算上清液中IDM的含量，并繪制相溶解度曲線圖。

1.2.3 IDM/β-CD包合物的制備

通常情況下，谷物原料如玉米需經過粉碎加工后用于配制飼料，主要是可以增加飼料與消化液的接觸面積[8]，提高飼料的利用率，從而提高動物的生產性能。本試驗在蛋雞產蛋期極顯著改善了產蛋率,平均蛋重,平均采食量，料蛋比和不合格蛋率。飼料營養(yǎng)均衡，有效促進蛋雞消化與提高生產性能。

包合物采用飽和溶液法[13-14]制備，根據相溶解度圖，分別精密稱取適量的IDM和β-CD，根據1.2.2所述方法制備IDM/β-CD包合物混懸液，抽濾，并用乙醇洗滌，真空干燥24 h，得IDM/β-CD包合物。

1.2.4 IDM/β-CD/ES100納米粒的制備

通過乳化溶劑揮發(fā)法對IDM/β-CD進行包衣，制備IDM/β-CD/ES100納米粒，如圖1所示為IDM/β-CD/ES100納米粒的制備方法示意圖。25 mL含有2% Span80的液體石蠟作為連續(xù)相，IDM/β-CD與ES100質量比為1︰1、1︰1.5和1︰2，分別分散于3 mL丙酮中作為分散相。將上述分散相在快速攪拌下逐滴滴加入連續(xù)相中，攪拌30 min。再將上述體系于 35 ℃、真空、200 r/min 條件下攪拌 3 h，使丙酮揮發(fā)。抽濾，并用正己烷洗去殘留外液，再真空干燥24 h，得 IDM/β-CD/ES100 納米粒。

圖1 IDM/β-CD/ES100納米粒的制備方法示意圖

1.2.5 包封率和載藥量的測定

精密稱取IDM/β-CD/ES100納米粒適量，溶解于適量pH 7.8的PBS中，并置于37 ℃恒溫振蕩器中透析48 h，以保證IDM/β-CD完全釋放。用紫外可見分光光度計測定透析袋外部溶液的吸光度A，通過標準曲線計算溶液中IDM/β-CD的含量。納米粒載藥量（Drug loading capacity，LC）及包封率（Encapsulation efficiency，EE）計算方法如式1和式2所示。

式中：WA為初始投藥量，WB為上清液中含藥量，WS為納米粒質量。

1.2.6 IDM/β-CD/ES100納米粒的表征

（1）粒徑和Zeta電位的測定：IDM/β-CD/ES100納米粒的粒徑、Zeta電位以及多分散指數（Particle dispersion index，PDI）使用LPSA 進行測定（n=3）。（2）形貌觀察：微球的表面形態(tài)通過SEM進行觀察。（3）X-射線衍射光譜分析：使用XRD分別對IDM、ES100、β-CD和納米粒粉末進行掃描，以觀察晶型變化，掃描范圍為5°～60°。

一般來說，口服藥物在胃中的運轉時間為2 h，在小腸中的運轉時間為2 h，而后到達結腸。因此，本研究采用的體外釋放實驗先在胃液環(huán)境（pH 1.2的 HCl）中進行釋放 2 h，再在小腸環(huán)境（pH 6.8的PBS）中釋放 2 h，最后轉移至結腸環(huán)境（pH 7.8的PBS）中釋放，以準確觀察納米粒在人體消化道pH變化環(huán)境中的體外釋放情況[15]。

取適量納米粒分散于 5 mL pH 1.2 的鹽酸溶液中，并將此溶液裝入透析袋，放置于 25 mL pH 1.2 的鹽酸溶液中；2 h后轉入pH 6.8的PBS中，再經2 h轉入pH 7.8的PBS中分別進行釋藥[16]，上述3個過程均在37 ℃水浴恒溫震蕩器中完成。定時取樣5 mL，同時補加相應體積的外液，對pH 1.2和pH 6.8的取出液，先將其pH值調整至7.8，再于320 nm波長處測定取出液的吸光度A，按照標準曲線計算取出樣品中的IDM/β-CD含量，繪制藥物的累積釋放曲線。

2 結果與討論

2.1 標準曲線的繪制

IDM在pH 7.8的PBS中的標準曲線如圖2所示，A=0.020 2C-0.007 8（R2=0.999 7），線性關系良好，線性范圍 7.24～72.40 μg/mL。

圖2 IDM在pH 7.8的PBS中的標準曲線

2.2 相溶解度圖

從圖3相溶解度圖可以算出，相溶解度曲線為：b=0.346a+0.318（R2=0.983 2）；S0=0.318 mmol/L，包和常數K=1 663.7，K值越大，表明此包合物越穩(wěn)定。同時，從圖3可以看出，IDM隨β-CD的增加而線性增加，說明形成了1︰1的包合物[17-18]。

圖3 β-CD的相溶解度曲線

2.3 納米粒載藥分析

ES100載DM/β-CD納米粒的LC和EE通過對應公式計算得出。IDM/β-CD、ES100的比例為1︰1時，所制備納米粒的EE較低，僅為46.33%，其原因可能是ES100太少，藥物未被包載的量增多，因此EE降低；當IDM/β-CD、ES100的比例為1︰1.5和1︰2時，納米粒EE相差不大，但LC隨著ES100的增加而降低。綜合考慮，取IDM/β-CD、ES100的比例為1︰1.5時較好，此時納米粒的LC和EE分別為21.14%±0.79%和57.47%±0.96%。

2.4 納米粒粒徑和Zeta電位

IDM/β-CD、ES100比例為1︰1.5時制備的納米粒粒徑分布如圖4所示。通過計算3次粒徑的平均值，得其粒徑為（383.0±6.9）nm。當Zeta電位絕對值＞10時，粒子由于表面電荷互相排斥，不易發(fā)生聚集等現象。本實驗所得納米粒的Zeta電位為（-23.0±0.5）mV，比較穩(wěn)定，分散性較好。

圖4 IDM/β-CD/ES100納米粒的粒徑分布

2.5 納米粒形貌分析

IDM/β-CD、ES100比例為1︰1.5納米粒的電鏡圖如圖5所示。從圖中可以觀察到納米粒的形態(tài)為球形，具有良好的分散性，納米粒的粒徑在260 nm左右。此粒徑比LPSA測得的結果稍小，其原因在于LPSA測定時樣品處于水環(huán)境中，粒子表面較為伸展，而使用SEM觀察樣品時，樣品處于干燥條件下，導致粒子發(fā)生少許皺縮。

2.6 XRD圖譜分析

圖 6為 IDM、ES100、β-CD 和 IDM/β-CD/ES100納米粒的XRD掃描圖譜。從圖中可知，IDM（圖6A）具有多個很強的晶體吸收峰；ES100（圖6B）在2θ=17°和2θ=20°處有兩個細且尖的吸收峰；β-CD（圖6C）在2θ=10°和2θ=20°有兩個較寬的吸收峰；IDM/β-CD/ES100納米粒（IDM/β-CD︰ES100=1︰1.5）（圖6D）的衍射圖中，在2θ=10°和2θ=15°處有兩個較弱的吸收峰，但IDM的吸收峰、β-CD 在 2θ=20°和 ES100 在 2θ=17°及 2θ=20°處的吸收峰都消失。這表明，IDM、ES100和β-CD在制備成納米粒時，不是簡單重結晶，可能發(fā)生了一定的相互作用。

圖5 IDM/β-CD/ES100納米粒的SEM圖

圖6 XRD掃描圖譜

2.7 體外釋藥試驗

模擬IDM/β-CD/ES100納米粒在消化系統中的釋藥曲線如圖7所示。從圖7可知，在pH 1.2的鹽酸溶液中，2 h后，IDM/β-CD、ES100比例為1︰1的納米粒，IDM/β-CD釋放約10%，而對于IDM/β-CD、ES100比例為1︰1.5和1︰2的納米粒，IDM/β-CD釋放約 5%。這是由于 IDM/β-CD在ES100表面所致，而1︰1的納米粒中，IDM/β-CD釋放率比其他兩個比例高，主要原因在于ES100太少，包衣不完全，導致更多的IDM/β-CD暴露于溶液中。在pH 6.8的PBS中，2 h后，1︰1的納米粒IDM/β-CD累積釋放約50%，而1︰1.5和1︰2的納米粒，IDM/β-CD釋放比較接近，累積釋放27%左右，其原因是ES100少量溶解，IDM/β-CD隨之釋放出來；在pH 7.8的PBS中，2 h后，1︰1的納米粒，IDM/β-CD累積釋放約95%，而1︰1.5和1︰2的納米粒，IDM/β-CD累積釋放60%左右，在17 h以后，1︰1的納米粒IDM/β-CD的釋放率不再增加，說明藥物完全釋放，而其他兩個比例的納米粒的釋放率還在升高。從圖7可以得出，IDM/β-CD、ES100比例為1︰1.5和1︰2的納米粒，緩釋效果基本相當，都遠遠好于1︰1的納米粒，具有良好的結腸釋藥靶向性。

圖7 IDM/β-CD/ES100納米粒在pH 1.2、6.8和7.8的介質中的體外釋藥曲線

3 結論

本文用β-CD成功地制備了IDM/β-CD包合物，增加了IDM在水相中的溶解度。并進一步利用乳化溶劑揮發(fā)法，成功地對IDM/β-CD進行了包衣，制備出粒徑在260 nm左右、穩(wěn)定性良好的IDM/β-CD/ES100球形納米粒。體外釋藥實驗表明，當IDM/β-CD、ES100比例不超過1︰1.5時，納米粒具有良好的結腸釋藥靶向性。