崔倩倩，劉朝陽(yáng)

（1.中冶華天工程技術(shù)有限公司，江蘇南京 210019；2.中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所，江蘇南京 210008）

隨著石油工業(yè)的發(fā)展，石油污染問(wèn)題越來(lái)越引起人們的關(guān)注。據(jù)估計(jì)，全世界每年約有1×109t石油及其產(chǎn)品進(jìn)入地下水、地表水及土壤中，對(duì)自然環(huán)境、人體健康、水產(chǎn)養(yǎng)殖等方面造成了嚴(yán)重影響。石油是由多種烴類和非烴類組成的復(fù)雜混合物，烷烴作為石油的重要成分，占石油中含量的50%～95%[1]。已有的研究報(bào)道表明，長(zhǎng)鏈烷烴結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易自然降解，大量存在被石油污染的環(huán)境中[2-3]。而原油中的飽和烴，特別是中間長(zhǎng)度的烷烴（C10～C20）更容易被生物降解。烷烴是石油中含量最多的成分，正十六烷烴是烷烴中的一種重要成分，水溶性低、難揮發(fā)，一旦進(jìn)入環(huán)境就很難被消除，屬于持久性污染物[4]。

利用物理、化學(xué)方法處理石油烴可以得到較好的效果，但因造價(jià)高、二次污染等問(wèn)題，其應(yīng)用受到了限制[5]。相比物理和化學(xué)處理方法，生物處理方法具有很大的優(yōu)勢(shì)，微生物能夠通過(guò)生物降解方式處理含油成分，具有處理效果好、 費(fèi)用低、對(duì)環(huán)境影響小及應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。可以降解石油污染物的微生物種類繁多，可利用多種微生物混用來(lái)降解不同烷烴，但在實(shí)際應(yīng)用中存在不同菌株適用條件不一致、菌群穩(wěn)定性差等問(wèn)題，應(yīng)用受到限制，因此篩選得到一株高效的烷烴降解菌具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

酵母浸出粉，OXOID LP0021生物試劑；蛋白胨，北京奧博星生物試劑；NaCl、MgSO4·7H2O、(NH4)2SO4、K2HPO4、KH2PO4均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；正十六烷 烴，色 譜 純，Sigma-Aldrich；TransStart FastPfu DNA聚合酶，北京全式金生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒，Omega公司；DNA ladder，Thermo公司。

DR5000紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，哈希；GC-2010 Pro氣相色譜，日本島津；PCR儀，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；LP5200P電子天平，德國(guó)Sartorius；MLS-3750全自動(dòng)高壓滅菌器，日本SANYO；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱，蘇州江東精密儀器有限公司；THZ-300C型恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科技有限公司。

1.2 樣品采集

試驗(yàn)中用于篩選高效石油烴降解菌株的土壤樣品采自東營(yíng)勝利油田采油廠附近被原油重度污染的土壤。用以配制富集培養(yǎng)基的原油采自東營(yíng)勝利油田采油廠原油。用以測(cè)定石油烴降解效果的廢水取自某汽車生產(chǎn)廠內(nèi)的含汽油、柴油廢水。

1.3 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：原油1 g/L，酵母粉3 g/L，NaCl5 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，(NH4)2SO41g/L，K2HPO410 g/L，KH2PO44 g/L，pH 為 7.2～7.4。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：酵母粉 3 g/L，NaCl 5 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，(NH4)2SO41g/L，K2HPO410 g/L，KH2PO44 g/L，pH 為 7.2～7.4。

分離培養(yǎng)基：酵母粉 5 g/L，蛋白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂 20 g/L，pH 為 7.0。

1.4 烷烴降解菌的富集分離

稱取10 g受原油污染的土壤加入到富集培養(yǎng)基中，置于 30 ℃、150 r/min的搖床培養(yǎng) 7 d，然后取2 mL培養(yǎng)液到新鮮的富集培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)7 d，取富集培養(yǎng)液1 mL，用無(wú)菌水按照體積比稀釋為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的菌懸液，取100 μL稀釋好的濃度梯度的菌懸液均勻地涂布在固體LB平板上，倒置放于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待長(zhǎng)出單菌落后挑取形態(tài)差異較大的單菌落劃線分離，挑取劃線后單菌落菌株，LB斜面保存于4 ℃中。

1.5 烷烴降解菌的篩選

將挑取出來(lái)的單菌落活化，按1%比例轉(zhuǎn)接到含正十六烷烴的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h，測(cè)定菌株的OD600（菌液在 600 nm波長(zhǎng)處的吸光度），選取生長(zhǎng)狀況較好的菌株作為初篩菌株，通過(guò)氣相色譜測(cè)試初篩菌株對(duì)正十六烷烴的降解率，確定復(fù)篩菌株，得到對(duì)正十六烷烴降解率最高的菌株。

上述方法的測(cè)試方法為：正十六烷的萃取使用液-液萃取技術(shù)，用正己烷作萃取劑，用氣相色譜火焰電離檢測(cè)器（GC-FID）分析正十六烷的含量。具體操作方法如下：（1）將5 mL的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到50 mL離心管中，在培養(yǎng)液中加入2 mL色譜純正己烷，劇烈攪拌2 min，將此混合液倒入分液漏斗中反復(fù)振蕩，靜置分層，吸取上層有機(jī)相至10 mL容量瓶中，按以上步驟重復(fù)萃取2次。合并萃取液在5 000 r/min下離心10 min，收集上層清液，用正己烷定容至25 mL，之后液體通過(guò)0.22 μm聚四氟乙烯過(guò)濾器。

GC-FID的測(cè)定條件為：AHP-5MS柱（Agilent，USA）（5%苯基柱，95%甲基硅；長(zhǎng)30 m×直徑0.025 mm× 膜厚度 0.25 μm）在 120 ℃下保持 1 min，以 20 ℃ /min 增加到 180 ℃，在 180 ℃下保持 5 min。氮?dú)庾鳛檩d流氣體，控制流速恒定為1.5 mL/min。注射器和檢測(cè)器的溫度分別為250 ℃和270 ℃，注射體積為 2 μL。

1.6 烷烴降解菌的菌株鑒定

將篩選到的對(duì)正十六烷烴降解率最高的菌株離心收集菌體，采用細(xì)菌提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，并采用正向引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' ）和反向引物 1492R（5'-CGGGCGGTGTGTACAAG-3' ）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收擴(kuò)增的片段送至美吉生物進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)得序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中經(jīng)NCBI Blast檢索比對(duì)，確定菌株種屬。

1.7 烷烴降解菌的乳化能力

表面活性劑是烴類降解的主要影響因素，表面活性劑能增強(qiáng)有機(jī)物的親水性，使生物降解速度得到很大程度的提高。乳化力測(cè)定：將培養(yǎng)液離心（9 000 r/min，4 ℃，20 min），取 2 mL 上清液加入 2 mL 正十六烷烴振蕩5 min，觀察分層液面的高度。

2 結(jié)果與分析

2.1 可降解長(zhǎng)鏈烷烴微生物的富集分離結(jié)果

取在富集培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)液梯度稀釋涂布分離平板，如圖1所示，分離挑取12株具有不同形態(tài)的單菌落菌株進(jìn)行劃線分離。將其劃線得到純化的菌株，LB斜面劃線，4 ℃保存。

2.2 可降解長(zhǎng)鏈烷烴微生物的篩選

將純化后的單菌落活化，接種于含0.1%正十六烷烴的5 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基試管中，將其放置于30 ℃、150 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)24 h，目測(cè)菌株P(guān)3、P7、P12菌液濁度較大，其他菌株培養(yǎng)液濁度較小。用分光光度計(jì)測(cè)定菌株的OD600，結(jié)果如圖2所示。發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)3、P7、P12生長(zhǎng)狀況較好，其中菌株P(guān)7的OD600最大，說(shuō)明三株菌株可以以烷烴為唯一碳源生長(zhǎng)。選取P3、P7、P12為初篩菌株，采用氣相色譜法檢測(cè)菌株對(duì)烷烴的降解率，確定P12為降解性能最好的菌株，如圖3所示降解率達(dá)到74.8%。

圖1 分離挑選的12株單菌落

圖2 以正十六烷烴為唯一碳源的不同菌株的OD600

圖3 初篩菌株對(duì)正十六烷烴降解率

2.3 菌種的鑒定

取P12菌株5 mL送上海美吉生物有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果 16S rDNA 基因序列長(zhǎng) 2 065 bp，經(jīng)GenBank中Blast檢索比對(duì)，該菌株P(guān)12與Acinetobacter junii的相似度達(dá)99%，確定菌株P(guān)12為瓊氏不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter junii），命名為Acinetobacter juniiP12。于2019年5月30日保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（簡(jiǎn)稱CGMCC），地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，其保藏號(hào)為 CGMCC NO.17873。

2.4 菌株乳化能力測(cè)試

如圖4所示，加入P12菌株上清液的正十六烷烴液面下降，有乳化現(xiàn)象產(chǎn)生。生物乳化劑屬于表面活性物質(zhì)，分子由疏水和親水兩部分構(gòu)成，同時(shí)具有親脂和親水的性質(zhì)，因此可增加油水的接觸面積，從而促進(jìn)微生物對(duì)石油類污染物的降解效果。

圖4 P12菌株的生物乳化作用

2.5 菌株的最適降解條件

2.5.1 最適降解溫度

將菌株Acinetobacter juniiP12接種到含有體積比為0.1%的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為150 r/min和培養(yǎng)溫度分別為 15 ℃、20 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48 h，采用氣相色譜法檢測(cè)溫度對(duì)菌株降解正十六烷烴的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。由結(jié)果可以看出，菌株最適宜溫度為30 ℃。溫度直接影響酶的活性，而微生物作用于烴類主要依靠酶催化反應(yīng)對(duì)其進(jìn)行降解。該菌株適宜溫度范圍為25～40 ℃，具有較廣的溫度利用范圍。

圖5 Acinetobacter junii P12在不同溫度下對(duì)正十六烷烴的降解曲線

2.5.2 最適降解pH

將P12接種到含正十六烷烴體積比為0.1%濃度的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基分別調(diào)節(jié)pH為3、5、7、9、11，在轉(zhuǎn)速為 150 r/min 和溫度為 30 ℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48 h，采用氣相色譜檢測(cè)pH對(duì)菌株Acinetobacter juniiP12降解正十六烷烴的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6。pH值為6～8，菌株對(duì)正十六烷烴都具有較好的降解率，可在此范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用，其中在pH為7的條件下降解效果最好。

圖6 Acinetobacter junii P12在不同pH下對(duì)正十六烷烴的降解曲線

2.5.3 菌株對(duì)含石油烴廢水的處理

將取自汽車生產(chǎn)廠內(nèi)的含汽油、柴油的廢水，用該廢水配制無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，將菌株活化培養(yǎng)的C12菌株轉(zhuǎn)接到該無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min繼續(xù)培養(yǎng)7 d。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，用該廢水配制無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，不接菌，其余與實(shí)驗(yàn)組條件一致，分別對(duì)比兩組中石油烴的含量。結(jié)果顯示加入該降解菌可降解總石油烴的54%，說(shuō)明該菌株對(duì)正十六烷烴不具專一性，也可以降解其他的烴類物質(zhì)，在石油烴污染的水體中具有很好的應(yīng)用潛力。

3 結(jié)論與展望

本研究獲得的瓊氏不動(dòng)桿菌Acinetobacter juniiP12篩選自受石油污染的土壤中，因此該菌株進(jìn)入石油污染的環(huán)境中能很快成為優(yōu)勢(shì)菌群，有效促進(jìn)烷烴的降解，對(duì)污染修復(fù)具有很重要的作用。同時(shí)，該菌株是以單一菌株實(shí)現(xiàn)對(duì)烷烴的高效率降解，減少了混合菌株制備過(guò)程中不同菌株單獨(dú)培養(yǎng)、分別活化、按比例混合等復(fù)雜操作步驟，方便應(yīng)用，并且應(yīng)用條件較好控制。此外，該菌株產(chǎn)生的生物乳化作用將提高烴類污染物在水中的溶解度，更有利于水體和土壤中石油類污染物的治理和生物修復(fù)。對(duì)于成分更復(fù)雜的原油物質(zhì)，如果嘗試將該菌株與其他優(yōu)勢(shì)菌株建立混合菌群，可通過(guò)菌群之間的協(xié)同作用，嘗試解決對(duì)其他烷烴降解效果不足的問(wèn)題，更有利于環(huán)境的治理[6-7]。在以后的研究中可以加強(qiáng)對(duì)極端環(huán)境下降解菌的研究，同時(shí)加強(qiáng)與分子生物學(xué)、物理化學(xué)等交叉學(xué)科融合創(chuàng)新，加強(qiáng)石油污染的聯(lián)合修復(fù)和積極推廣。