劉珍巧，陳青青，王豫蓉

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，口腔疾病與生物醫(yī)學(xué)重慶市重點實驗室，重慶市高校市級口腔生物醫(yī)學(xué)工程重點實驗室, 重慶 401147

中頻電刺激是應(yīng)用頻率為1 ～100 kHz 的脈沖電流治療疾病的一種物理方法，具有鍛煉肌肉的作用，現(xiàn)已在康復(fù)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，其在頜面部的面癱、吞咽功能障礙等疾病中的療效也得到了肯定[2-3]。神經(jīng)營養(yǎng)因子3 （neurotrophin-3，NT-3）是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的一員。有資料[4-6]顯示：運動可以增強NT-3 表達，促進神經(jīng) - 肌肉接頭（neuromuscular junction，NMJ）成熟，且主要集中在發(fā)育的早期；隨著肌細胞成熟，NT-3 表達逐漸降低。

本實驗使用頰車穴位中頻電刺激作用于功能矯治大鼠咬肌，旨在了解NT-3 在中頻電刺激誘導(dǎo)的咬肌神經(jīng)肌肉改建中的作用，探討功能矯治聯(lián)合頰車穴位中頻電刺激作為一種新的功能矯治器應(yīng)用于臨床的可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選取4 周齡健康雄性SD 大鼠60 只［購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（渝）2018-0003，動物使用許可證號為SYXK（渝）2018-0003］。所有動物均于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院實驗室SPF 級環(huán)境喂養(yǎng)，實驗前自由飲水、攝食。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫22 ～25 ℃，平均相對濕度為30%～40%。按隨機分組原則分為3 組：空白對照組、條件對照組（戴用矯治器，不進行中頻電刺激）、實驗組（進行中頻電刺激，同時戴用下頜前導(dǎo)矯治器），每組20 只。

1.2 儀器及試劑

在前期實驗[7]中已證實下頜前伸模型的有效性。參照相關(guān)文獻[8]改良導(dǎo)下頜向前裝置，裝置由甲基丙烯酸甲酯材料的斜面導(dǎo)板和富士Ⅰ型玻璃離子粘固劑制成。

中頻電治療儀ZM-CIA 購自中國HLIFE 公司，Z233MK-2 低溫離心機購自德國HERMLE 公司，顯微病理圖文分析系統(tǒng)購自日本Olympus 公司，C-1000 熒光定量PCR 儀購自美國BIO-Rad 公司。兔抗大鼠NT-3 抗體購自美國Immunoway 公司，蘇木精-伊紅（H-E）染色試劑盒與SABC 試劑盒均購自美國Solarbio 公司，TRIGene 總RNA 提取試劑盒與反轉(zhuǎn)錄試劑盒StarScript Ⅱ Green Two-Step qRT-PCR Synthesis Kit 均購自中國GenStar 公司。

1.3 實驗動物模型建立

大鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后，利用玻璃離子粘固劑將上頜斜面導(dǎo)板粘固于大鼠上切牙；輔以防護頸圈，防止大鼠前爪破壞矯治器及抓傷面部，全天佩戴。有文獻[9]報道，通過針刺頰車穴可出現(xiàn)神經(jīng)、肌肉功能改善。因此，本實驗選取雙側(cè)頰車穴，對實驗組大鼠進行中頻電刺激。穴位定位根據(jù)《大鼠穴位圖譜的研制》[10]及《實驗大鼠針灸俞穴圖譜及針刺手法》[11]并比較解剖學(xué)原理，參照人體經(jīng)穴定穴，“頰車穴”位于下頜角前上方咬肌最豐隆處中點。使用組織剪剪去咬肌處及其周圍毛發(fā)，敷以甘油，以防止大鼠皮膚干燥損傷。電刺激前，于大鼠咬肌處涂抹生理鹽水加強導(dǎo)電性，中頻電治療儀連接電極片，極片置于大鼠頰車穴，選擇處方9（鍛煉肌肉處方），頻率為4 kHz，波形為正弦波，調(diào)整刺激強度，使其略高于肌肉收縮閾值，使面部肌肉輕微顫動，持續(xù)時間為15 min，每日1 次。

1.4 標本制備

分別在第3、7、14、21 日每組隨機選取5 只SD 大鼠斷頸處死。對各組大鼠進行解剖。取左側(cè)咬肌中段置于凍存管中，迅速轉(zhuǎn)移至液氮中，于NT-3 的PCR 檢測備用。取右側(cè)咬肌中段置于現(xiàn)配的4%多聚甲醛中固定12 h，脫水、透明、石蠟包埋。為觀察肌肉纖維形態(tài)及組織變化，每塊組織做連續(xù)縱切片，以備進行H-E 染色及免疫組織化學(xué)染色。

1.5 H-E 染色

取上述切片依次行常規(guī)脫蠟、復(fù)水、H-E 染色、脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察，采集圖像并分析。

1.6 SABC 法免疫組織化學(xué)染色

取上述切片依次行脫蠟，復(fù)水，滅活內(nèi)源性酶，熱修復(fù)抗原，5% BSA 封閉，一抗4 ℃過夜，二抗37 ℃孵育，DAB 顯色，復(fù)染細胞核及脫水封片，顯微鏡下觀察，采集圖像并分析。

1.7 實時熒光定量PCR

取一定量的液氮凍存咬肌標本于研磨專用管，加入研磨用小鋼珠以及1 mL TRIzol，行組織塊研磨、勻漿；按照TRIzol 試劑盒操作說明提取總RNA。用紫外分光光度計檢測RNA 的濃度及純度[D （260 nm）/D （280 nm）達到1.8 ～2.0]，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。實時熒光定量PCR（qPCR）反應(yīng)條件為95 ℃ 90 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，共計40 個循環(huán)。結(jié)果分析采用2-△△CT法。引物（表1）的合成及設(shè)計由Invitrogen 公司完成。

表1 qPCR 引物序列Tab 1 Primer sequences for qPCR

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 咬肌再生性改變

空白對照組、條件對照組及實驗組在第7 日的H-E染色結(jié)果見圖1。觀察細胞核和肌纖維在肌肉組織中的位置和數(shù)量，可見條件對照組和實驗組均出現(xiàn)細胞核從邊緣向中心移動的現(xiàn)象；實驗組細胞核數(shù)量明顯增多；各組肌纖維數(shù)量基本穩(wěn)定；在條件對照組和實驗組中，咬肌纖維并未出現(xiàn)斷裂和退行性變，表現(xiàn)為再生而非 變性。

圖1 H-E 染色觀察咬肌再生性改變（×400）Fig 1 Regeneration of masseter muscle observed by H-E staining (×400)

2.2 咬肌中NT-3 蛋白的表達變化

NT-3 免疫組織化學(xué)染色陽性結(jié)果為細胞核藍染，細胞質(zhì)呈棕褐色（圖2）。對其灰度值[積分光密度（integral optical density，IOD）]進行分析，結(jié)果顯示（圖3）：與空白對照組比較，條件對照組在第3 日、第7 日NT-3 蛋白的表達未見明顯變化（均P＞0.05），在第14 日、第21日 NT-3 蛋白的表達明顯上升（均P＜0.05）；實驗組第3日 NT-3 蛋白的表達水平與其他2 組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；與空白對照組比較，實驗組第7日、第14 日NT-3 蛋白的表達明顯上升（均P＜0.05）；與條件對照組相比較，實驗組第7 日NT-3 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），而在第14 日、第21 日2 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。進一步分析發(fā)現(xiàn)，條件對照組第21日出現(xiàn)NT-3 蛋白表達降低，而實驗組在第14 日、第21日NT-3 蛋白的表達呈逐步降低的趨勢。

圖2 SABC 免疫染色觀察咬肌中NT-3 蛋白的表達變化（×400）Fig 2 Changes of expression of NT-3 protein in masseter muscle by SABC staining (×400)

圖3 各組大鼠咬肌中NT-3 蛋白表達水平的比較Fig 3 Comparison of NT-3 protein expression in masseter muscle of rats among the groups

2.3 咬肌中NT-3 mRNA 的表達變化

將空白對照組第3 日 NT-3 mRNA 作為校準品，計算2-△△CT值。結(jié)果顯示（圖4），與空白對照組比較，條件對照組在第3 日、第7 日尚未出現(xiàn)明顯的NT-3 mRNA 表達的差異（P＞0.05），第14 日、第21 日NT-3 mRNA 表達明顯上升（P＜0.05）；與空白對照組比較，實驗組第3 日NT-3 mRNA 表達無明顯變化（P＞0.05），在第7 日、第14日 NT-3 mRNA 表達明顯上升（P＜0.05）。與條件對照組比較，第7 日實驗組NT-3 mRNA 表達明顯上升（P＜0.05）。由圖4 可見，隨著時間的延長，條件對照組在第14 日出現(xiàn)NT-3 mRNA 表達的明顯上升，在第21 日降低；而實驗組在第7 日即出現(xiàn)NT-3 mRNA 表達的明顯上升，而后逐漸降低，并基本恢復(fù)至空白對照組的水平。

圖4 各組大鼠咬肌中NT-3 mRNA 表達水平的比較Fig 4 Comparison of NT-3 mRNA expression in masseter muscle of rats among the groups

3 討論

中頻電刺激可增強骨骼肌收縮，通過骨骼肌改建產(chǎn)生康復(fù)作用。骨骼肌改建又反過來刺激突觸前運動神經(jīng)末梢，促進了NMJ 的成熟，形成一個正向強化模型，從而加強骨骼肌的神經(jīng)肌肉改建[12]。本實驗中對功能矯治大鼠進行頰車穴位中頻電刺激后，咬肌細胞中NT-3 蛋白的變化與NT-3 mRNA 的表達變化趨勢基本一致，證實NT-3 mRNA 的突觸活動依賴性表達，使大鼠咬肌出現(xiàn)NT-3 蛋白的釋放增加[13]。其他相關(guān)研究[14-15]也顯示，骨骼肌進行主動訓(xùn)練后，NT-3 表達顯著上升。NT-3 可促進突觸前運動神經(jīng)元軸突的生長[6]，并調(diào)節(jié)膠質(zhì)細胞活性，影響施萬細胞與運動神經(jīng)元的相互作用，促進突觸成熟[16]。另有研究[17]顯示電刺激促進軸突出芽生長，顯著增加運動神經(jīng)元的數(shù)量，推測功能矯治聯(lián)合頰車穴位中頻電刺激對大鼠咬肌神經(jīng)的改建有正向作用。

神經(jīng)營養(yǎng)因子家族在神經(jīng)肌肉改建的不同階段發(fā)揮作用，其中NT-3 表達一般在突觸成熟的早期上升，在后期逐漸降低[18]。在實驗初期，空白對照組、條件對照組以及實驗組大鼠咬肌NT-3 蛋白及mRNA 的表達在第3 日時的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。有研究[19]顯示，主動鍛煉大鼠的骨骼肌中NT-3 mRNA 的表達在第5 日上升。因此，推測條件對照組和實驗組大鼠的咬肌在第3 日可能并未產(chǎn)生神經(jīng)肌肉改建。實驗第7 日，中頻電刺激組大鼠已經(jīng)出現(xiàn)明顯的NT-3蛋白及mRNA 的表達上升。NT-3 蛋白增多，作用于突觸前神經(jīng)末梢的酪氨酸激酶C 受體，使突觸前神經(jīng)末梢釋放更多乙酰膽堿，肌細胞膜上的乙酰膽堿受體結(jié)合位點增加，觸發(fā)更強的突觸后反應(yīng)和化學(xué)反應(yīng)，增強肌肉功能，同時突觸活性增強使NT-3 mRNA 表達上升，形成正向強化模型，提高神經(jīng)肌肉改建的效率[20-21]。接受中頻電刺激的大鼠可能在戴用下頜功能矯治器的早期即出現(xiàn)了活躍的神經(jīng)肌肉改建，而條件對照組大鼠咬肌在第14 日才開始出現(xiàn)NT-3 蛋白及mRNA 表達的上升。僅戴用功能矯治器的大鼠，其咬肌神經(jīng)肌肉的改建可能相對于接受中頻電刺激的大鼠有所滯后。

研究[22]顯示，在發(fā)育完成的突觸中NT-3 表達保持在低水平。本實驗中功能矯治大鼠NT-3 蛋白及mRNA 的表達變化整體呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，條件對照組大鼠第21 日NT-3 蛋白及mRNA 的表達與空白對照組仍有差異，NMJ 的發(fā)育可能尚未完成，僅戴用功能矯治器的大鼠咬肌可能仍處于神經(jīng)肌肉的改建期；而實驗組在第21 日大鼠咬肌NT-3 蛋白及mRNA 的表達水平基本恢復(fù)至矯治前，可能此時NMJ 已發(fā)育成熟，神經(jīng)肌肉改建在第21 日已基本完成。綜上，頰車穴位中頻電刺激可能縮短了功能矯治大鼠的神經(jīng)肌肉改建時間，使下頜適應(yīng)新的形態(tài)位，快速實現(xiàn)神經(jīng)肌肉改建的穩(wěn)定。

本研究結(jié)果表明，功能矯治聯(lián)合咬肌頰車穴位中頻電刺激，可導(dǎo)致大鼠早期出現(xiàn)NT-3 蛋白及mRNA 表達的上升，提高突觸成熟速率，增強肌肉功能，促進神經(jīng)肌肉改建，提前達到下頜前伸矯治結(jié)果的穩(wěn)定。功能矯治聯(lián)合咬肌頰車穴位中頻電刺激有望作為一種新的主動訓(xùn)練型功能矯治器應(yīng)用于臨床，但其臨床診療的具體參數(shù)及作用機制還有待進一步研究。

參·考·文·獻

[1] 李志華. 周期性牽張應(yīng)力作用下大鼠成肌細胞形態(tài)改變力學(xué)響應(yīng)機制的研究[D]. 成都: 四川大學(xué), 2004.

[2] 李冰潔, 張通, 李芳. 神經(jīng)肌肉電刺激對卒中后吞咽障礙治療作用的研究[J]. 中國卒中雜志, 2017, 12(3): 207-213.

[3] Kletzien H, Russell JA, Leverson G, et al. Effect of neuromuscular electrical stimulation frequency on muscles of the tongue[J]. Muscle Nerve, 2018, 58(3): 441-448.

[4] Chung JY, Kim MW, Im W, et al. Expression of neurotrophin-3 and trkC following focal cerebral ischemia in adult rat brain with treadmill exercise[J]. Biomed Res Int, 2017, 2017: 1-6.

[5] Li Y, Xia B, Li R, et al. Expression of brain-derived neurotrophic factors, neurotrophin-3, and neurotrophin-4 in the nucleus accumbens during heroin dependency and withdrawal[J]. Neuroreport, 2017, 28(11): 654-660.

[6] Sheard PW, Bewick GS, Woolley AG, et al. Investigation of neuromuscular abnormalities in neurotrophin-3-deficient mice[J]. Eur J Neurosci, 2010, 31(1): 29-41.

[7] 尹靈芝, 王強, 王豫蓉, 等. 穴位電針對功能矯治大鼠咀嚼肌基質(zhì)金屬蛋白酶-9 表達的影響[J]. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2013, 38(7): 751-754.

[8] 崔佳, 劉學(xué)聰, 劉昕, 等. 下頜功能性前伸后髁突部RANKL、MMP-2、MMP-9 及VEGF 水平變化的實驗研究[J]. 中國臨床研究, 2019, 32(4): 433-438.

[9] 李英南, 王健, 周鴻飛, 等. 不同深度針刺地倉、頰車穴對周圍性面癱患者生活質(zhì)量及面神經(jīng)功能的影響[J]. 中醫(yī)雜志, 2019, 60(2): 57-60.

[10] 華興邦, 周浩良. 大鼠穴位圖譜的研制[J]. 實驗動物與動物實驗, 1991(1): 1-5.

[11] 方宗疇. 實驗大鼠針灸俞穴圖譜及針刺手法[J]. 南京鐵道醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 1993, 12(1): 19-21.

[12] Qi YC, Niu XL, Gao YR, et al. Therapeutic effect evaluation of neuromuscular electrical stimulation with or without strengthening exercise on spastic cerebral palsy[J]. Clin Pediatr, 2018, 57(5): 580-583.

[13] Xie K, Wang T, Olafsson P, et al. Activity-dependent expression of NT-3 in muscle cells in culture: implications in the development of neuromuscular junctions[J]. J Neurosci, 1997, 17(9): 2947-2958.

[14] Ying Z, Roy RR, Edgerton VR, et al. Voluntary exercise increases neurotrophin-3 and its receptor TrkC in the spinal cord[J]. Brain Res, 2003, 987(1): 93-99.

[15] Akyol O, Sherchan P, Yilmaz G, et al. Neurotrophin-3 provides neuroprotection via TrkC receptor dependent pErk5 activation in a rat surgical brain injury model[J]. Exp Neurol, 2018, 307: 82-89.

[16] 楊海紅, 吳海濤. 神經(jīng)肌肉接頭突觸發(fā)育信號機制研究進展[J]. 生命科學(xué), 2017, 29(3): 277-291.

[17] Thomas HH. Clinical strategies to enhance nerve regeneration[J]. Neural Regen Res, 2015, 10(1): 22-24.

[18] Guo Y, Su ZJ, Chen YK, et al. Brain-derived neurotrophic factor/neurotrophin 3 regulate axon initial segment location and affect neuronal excitability in cultured hippocampal neurons[J]. J Neurochem, 2017, 142(2): 260-271.

[19] Gómez-Pinilla F, Ying Z, Opazo P, et al. Differential regulation by exercise of BDNF and NT-3 in rat spinal cord and skeletal muscle[J]. Eur J Neurosci, 2001, 13(6): 1078-1084.

[20] Todd KJ, Auld DS, Robitaille R, et al. Neurotrophins modulate neuron-glia interactions at a vertebrate synapse[J]. Eur J Neurosci, 2007, 25(5): 1287-1296.

[21] Li H, Lin S, Qin T, et al. Senegenin exerts anti-depression effect in mice induced by chronic un-predictable mild stress via inhibition of NF-κB regulating NLRP3 signal pathway[J]. Int Immunopharmacol, 2017, 53: 24- 32.

[22] Zhang YT, Jin H, Wang JH, et al. Tail nerve electrical stimulation and electroacupuncture can protect spinal motor neurons and alleviate muscle atrophy after spinal cord transection in rats[J]. Neural Plast, 2017, 2017: 7351238.