路芳芳，姚佳璐，鈕曉音，翁 震，何 楊,

1.江蘇省血液研究所，蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，蘇州 215006；2. 江蘇省蘇州市立醫(yī)院心內(nèi)科，蘇州 215002；3. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海市免疫學(xué)研究所，上海 200025；4. 蘇州大學(xué)血液和血管疾病診療藥物技術(shù)教育部工程研究中心，蘇州 215123

血管再狹窄（restenosis）是一類源于新生內(nèi)膜增殖的血管病變，在心臟和外周血管成形術(shù)、旁路移植術(shù)、動脈內(nèi)膜切除術(shù)及人工動靜脈簍術(shù)后均有可能出現(xiàn)，被認為是影響血管置換術(shù)和血管成形術(shù)遠期療效的主要原因[1]。臨床研究[2-3]顯示，血管再狹窄在進行血管重建術(shù)后的發(fā)生率仍然高達30%～50%。目前在臨床上，對于血管再狹窄的治療仍未找到較好的治療方法。近年來，研究[4]表明，內(nèi)側(cè)動脈層中過度的血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）增殖和遷移在內(nèi)膜增生性疾病的發(fā)病機制中起著重要作用。因此，如何有效抑制和控制VSMCs 的增殖和遷移是血管再狹窄疾病治療的重要切入點。

阿苯達唑（albendazole，ABZ）是一種咪唑衍生物類廣譜驅(qū)腸蟲藥物[4-5]。通過抑制寄生蟲細胞中微管形成和葡萄糖攝取發(fā)揮驅(qū)蟲作用。除了在驅(qū)蟲方面的作用外，ABZ還可以通過抑制腫瘤細胞的增殖或者通過某些信號通路上調(diào)腫瘤壞死因子的表達來誘導(dǎo)細胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。有研究[6-7]表明，微管的組裝和排列能夠影響VSMCs 的遷移。因此，我們推測ABZ 可能通過影響VSMCs 的生物學(xué)特性，包括增殖、遷移及凋亡，從而影響血管再狹窄的過程。本研究探討在外周套管誘發(fā)狹窄的小鼠模型中，ABZ 作為潛在治療藥物的作用效應(yīng)，并探究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人血管平滑肌細胞購自美國Life Technology 公司；ABZ、二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma 公司；細胞培養(yǎng)試劑包括DMEM/F12 培養(yǎng)基、胎牛血清及100×青霉素-鏈霉素溶液購自美國Thermo Fisher 公司；細胞遷移實驗試劑I 型膠原蛋白及材料Transwell 小室（孔徑8 μm）購自美國Millipore 公司；血小板衍生的生長因子BB（PDGF-BB）購自美國R&D 公司；抗體包括兔抗人磷酸化及總肌球蛋白輕鏈2、兔抗鼠磷酸化及總絲切蛋白（cofilin，CFL）、GAPDH 購自美國Cell signaling Technology 公司；Annexin V-PI 細胞凋亡試劑盒及細胞裂解液RIPA 液購自中國南通碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 實驗動物

雄性8 ～10 周齡C57BL/6 小鼠（體質(zhì)量22 ～25 g）購自北京維通利華公司，所有動物置于SPF 環(huán)境中進行飼養(yǎng)。動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2019-0009，使用許可證號為SYXK（蘇）2017-0043，動物實驗及處理方案經(jīng)過蘇州大學(xué)動物倫理委員會審批（審批號201810A530）。

1.3 細胞增殖實驗

將VSMCs 調(diào)整濃度至2×104個/mL 后接種于48 孔板中，每孔0.5 mL。隨后將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中靜置6 h 使細胞貼壁。隨后在不同孔中加入濃度為0.5、1 μmol/L 的ABZ 或等體積的DMSO 進行孵育培養(yǎng)，并在24 h 及48 h 時間點加入MTT 溶液，通過酶標(biāo)儀進行細胞存活率測定吸光度[D （490 nm） ]。

1.4 Transwell 細胞遷移實驗

參照相關(guān)文獻[8]，將500 μL Ⅰ型膠原蛋白（3.79 mg/mL） 與50 μL 的NaOH（0.2 mol/L）和100 μL 的100× 青 霉素-鏈霉素溶液混合后置于冰上，然后在混合溶液中加入3×105個重懸于250 μL DMEM/F12 的經(jīng)過血清饑餓處理5 ～6 h 的VSMCs，并充分混合。將等分的含有VSMCs的上述混合溶液（100 μL）轉(zhuǎn)移至24 孔Transwell 小室的上室中，隨后將Transwell 小室在37 ℃下孵育20 min以形成凝膠，取出后在下室中加入0.6 mL 含2.5% FBS、PDGF-BB 和ABZ（0.5 或1 μmol/L）或DMSO 對 照 的DMEM/F12 培養(yǎng)基。同時，在上室的凝膠上部加入含有2.5% FBS 和相同濃度的ABZ 或DMSO 對照的DMEM/F12 培養(yǎng)基（0.1 mL）進行覆蓋。然后，將Transwell 板置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)條件下孵育48 h。為了量化VSMCs 通過凝膠和Transwell 孔遷移至多孔膜下部腔室表面的過程，收集上部小室并通過浸入4%多聚甲醛中進行固定。用棉簽去除凝膠并拭去上室膜表面未遷移的細胞。割下Transwell 的多孔膜后，按照產(chǎn)品說明書用Diff-Quik染色套件（德國Siemens 公司）染色。于100 倍正置顯微鏡下隨機選取每個膜的4 個區(qū)域進行計數(shù)并求和，得出遷移細胞的總數(shù)。

1.5 流式細胞術(shù)評估細胞凋亡

將VSMCs 調(diào)整濃度至3×104個/mL 后接種于6 孔板中，每孔2 mL。隨后將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中靜置6 h 使細胞貼壁。隨后在不同孔中加入濃度為0.5、1 μmol/L 的ABZ 或等體積的DMSO 進行孵育培養(yǎng)，并在48 h 后采用Annexin V-FITC/PI 染色法評估細胞凋亡。將處理后的細胞與5 μL Annexin V-FITC 混合，在室溫下避光孵育10 min，隨后通過PBS 洗滌后加入10 μL PI于室溫下避光孵育10 min。使用Beckman-Coulter Gallios流式細胞儀進行細胞凋亡檢測，通過儀器自帶的Kaluza Analysis 軟件分析結(jié)果。

1.6 小鼠股動脈外周套管血管狹窄模型構(gòu)建及ABZ 處理

術(shù)前將小鼠通過腹腔注射50 mg/kg 戊巴比妥鈉進行麻醉。將其以仰臥位固定并置于解剖顯微鏡下，采用眼科剪在小鼠腿內(nèi)側(cè)切開一條1 ～2 cm 的縱向切口，并使用顯微鑷從股神經(jīng)和股靜脈與股動脈分離，長度為3 mm。采用長度為2.0 mm 縱向切開細孔PE 管（內(nèi)徑0.41 mm，外徑0.51 mm；英國Smith 公司）套在股動脈周圍，兩端套管通過6/0 縫合線結(jié)扎以實現(xiàn)血流部分阻斷。通過連續(xù)縫合針法縫合切口皮膚后，將小鼠置于干凈鼠籠靜待復(fù)蘇。

將建模后的小鼠進行分組，每組各10 只小鼠。①實驗組：每天用溶解于芝麻油中的1.5 mg ABZ 進行灌胃。②對照組：每天采用等體積的芝麻油進行灌胃。在模型建立后第2 天上午開始第一次灌胃，并將實驗組和對照組小鼠在模型建立后置于含有高脂飼料（TP28600，南通特洛菲飼料有限公司）的籠中進行飼養(yǎng)。4 周后通過心臟灌注含4%甲醛的PBS 處死動物，并獲得股動脈進行組織學(xué) 分析。

1.7 組織學(xué)和形態(tài)分析

切下兩側(cè)股動脈，包埋在石蠟塊中，切成5 μm 薄片并進行蘇木精 - 伊紅（H-E）染色。采用Leica DM2000 顯微鏡圖像采集后，從每條動脈中選擇每600 mm2截取的3 個 橫截面進行定量。使用Image J 軟件分析圖像。測量內(nèi)膜（intima）和中膜（media）區(qū)域，并計算內(nèi)膜與中膜的比例（I/M）。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）分析

將VSMCs 在0.5 或1 μmol/L ABZ 或 等 體 積DMSO存在的情況下，聯(lián)合20 ng/mL PDGF 處理24 ～48 h 后，使用適量的RIPA 溶液將VSMCs 裂解，12 000×g、4 ℃下離心15 min，獲得含有蛋白的上清溶液。經(jīng)過BCA 法進行蛋白定量后，將含有30 ～50 μg 蛋白的樣品溶液在10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下，將膜用5%脫脂牛奶中封閉2 h 后，在4 ℃條件下與一抗（1:1 000）孵育過夜。將PVDF 膜在含1% Tween-20 的PBS 中洗滌3 次后，與適當(dāng)濃度的HRP標(biāo)記的二抗（1:50 000 稀釋）于室溫下孵育1 h，重復(fù)上述洗膜后，采用ECL 底物試劑盒顯影曝光，對特異性蛋白條帶采用Image J 軟件進行半定量分析。采用GAPDH蛋白作為內(nèi)參對照。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 7 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s 表示。多組間比較采用單因素方差分析結(jié)合Tukey HSD 與SNK 檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ABZ 濃度確定

將VSMCs 與不同濃度的ABZ 進行孵育后，構(gòu)建IC50的曲線以明確ABZ 的使用濃度。結(jié)果顯示，ABZ 濃度為0.5 ～1 μmol/L 時能夠?qū)崿F(xiàn)對細胞生長的半數(shù)抑制（圖1）。 因此，采用0.5 和1 μmol/L 作為后續(xù)實驗的濃度。

圖1 ABZ 對細胞起效的最低濃度Fig 1 Minimum concentration of ABZ to act on cells

2.2 ABZ 對VSMCs 增殖和遷移的抑制作用

0.5 和1 μmol/L ABZ 均 能 夠 顯 著 抑 制VSMCs 的 增殖（圖2A）。細胞遷移實驗結(jié)果顯示0.5 和1 μmol/L ABZ均能夠顯著抑制VMSCs 的遷移（圖2B、2C）。通過流式細胞術(shù)觀察48 h 時ABZ 對VSMCs 凋亡的影響，結(jié)果顯示1 μmol/L ABZ 能夠顯著增加VSMCs 的凋亡，而在0.5 μmol/L 時無此效應(yīng)。

2.3 ABZ 對再狹窄小鼠模型新生內(nèi)膜增生的抑制作用

體外實驗結(jié)果提示ABZ 能夠影響VSMCs 的增殖和遷移，進一步通過股動脈外周套管法構(gòu)建了小鼠血管再狹窄的模型驗證ABZ 在體內(nèi)的作用效應(yīng)。結(jié)果顯示，與對照組小鼠比較，ABZ 灌胃能夠顯著降低新生內(nèi)膜面積及I/M比值（圖3），但是對中膜面積并無顯著效應(yīng)。

2.4 ABZ 干預(yù)血管再狹窄的作用機制

相較于對照溶劑DMSO 處理，0.5 和1 μmol/L ABZ處理均能夠顯著抑制CFL 去磷酸化和肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）的磷酸化，且呈現(xiàn)濃度依賴的趨勢（均P＜0.05），見圖4。

圖2 ABZ 對VSMCs 增殖、遷移及凋亡的影響Fig 2 Effects of ABZ on proliferation, migration and apoptosis of VSMCs

3 討論

VSMCs 在許多血管疾病中起著重要作用。在發(fā)生動脈損傷時，VSMCs 通過從靜止的收縮表型轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂性鲋承院瓦w移性的表型進行應(yīng)答。通過增生、遷移和細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，VSMCs 有助于在動脈粥樣硬化以及支架置入后再狹窄中出現(xiàn)的阻塞性血管病灶的形成[9]。隨著社會經(jīng)濟發(fā)展、生活水平的提高以及人口老齡化趨勢的到來，阻塞性血管病的發(fā)病率和死亡率呈增高趨勢。盡管目前在臨床上使用的藥物洗脫支架已成功地預(yù)防了再狹窄，但是由于每年植入支架患者的數(shù)量巨大，再狹窄和復(fù)發(fā)性再狹窄仍然很普遍。因此，在臨床實踐中仍需安全有效的方法來治療復(fù)發(fā)性再狹窄。

ABZ 是苯并咪唑氨基甲酸酯類驅(qū)蟲藥，其最初作為抗寄生蟲藥于1975 年問世，并以其對人體和農(nóng)場動物的功效和低毒性而備受關(guān)注[9]。ABZ 作為能夠結(jié)合β-微管蛋白受體的激動劑，通過改變微管蛋白聚合實現(xiàn)對寄生蟲的抑制[9]。ABZ 破壞微管聚合的潛在機制，促進了其作為微管結(jié)合劑用于抗腫瘤藥物的實驗研究。先前的研究[6,10]已經(jīng)確定了幾種苯并咪唑氨基甲酸酯（包括ABZ）在多種腫瘤細胞系中的抗腫瘤效應(yīng)，主要包括肺癌、白血病和皮下鱗癌。另外，也有研究[11]評價了關(guān)于ABZ 與 2-甲氧基雌二醇或紫杉醇的組合的協(xié)同抗腫瘤作用。此外，ABZ 可抑制血管內(nèi)皮生長因子的分泌并防止惡性腹水的形成。據(jù)報道[11]，ABZ 可以通過SIRT3/ROS/P38 MAPK/TTP 軸上調(diào)腫瘤壞死因子α（TNF-α）的水平，從而發(fā)揮抗腫瘤的作用。

圖3 ABZ 在再狹窄小鼠模型中對內(nèi)膜增生的抑制作用Fig 3 Effect of ABZ on intimal hyperplasia in a murine model of restenosis

圖4 ABZ 對CFL 和MLC 磷酸化的影響Fig 4 Effects of ABZ on CFL and MLC phosphorylation

本研究結(jié)果表明，ABZ 還可以抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移。這與微管組織的破壞和其他細胞骨架成分如絲狀肌動蛋白分布的繼發(fā)變化有關(guān)。ABZ 處理可能導(dǎo)致細胞骨架蛋白的重排，從而影響了VSMCs 的生物學(xué)功能。盡管由ABZ 誘導(dǎo)的凋亡可能有助于抑制作用，但該因素在血管狹窄模型中并非主要決定因素。重要的是，ABZ治療可有效減少動脈損傷后新內(nèi)膜的形成，而該作用被認為是通過在損傷部位抑制VSMCs 增殖和遷移介導(dǎo)的，而且并不影響體內(nèi)血管的再內(nèi)皮化。因此，該療法可用于治療與病理性VSMCs 增殖有關(guān)的血管疾病。另外，ABZ 的優(yōu)勢還在于具有較低的不良反應(yīng)風(fēng)險，并且這種低毒效應(yīng)即使在人體中進行長期服用亦是如此[9]。在本研究中，我們也未觀察到明顯的不良反應(yīng)。

目前，有關(guān)VSMCs 遷移的分子機制已得到充分描述，其始于將外部配體結(jié)合轉(zhuǎn)化為內(nèi)部生化事件的生長因子和炎癥細胞因子受體的結(jié)合，包括PDGF、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和腫瘤壞死因子在內(nèi)的多種可溶性配體復(fù)合物能夠在VSMCs誘導(dǎo)遷移[12]。而參與VSMC 遷移的蛋白主要包括GTPases（如RhoA 和Rac1）、絲裂原激活的蛋白（mitogen-activated protein，MAP）激酶（如p38）以及細胞骨架和肌動蛋白重構(gòu)蛋白[如CFL、MLC 及熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）27]。這些蛋白的協(xié)調(diào)激活使平滑肌細胞突出偽足，實現(xiàn)肌動蛋白重構(gòu)，并允許細胞向趨化刺激遷移。MLC 磷酸化是SMC 遷移中必不可少的生化事件，因為它啟動了肌球蛋白ATPase 活性、肌動蛋白聚合以及組織定向細胞運動所必需的功能性肌動蛋白-肌球蛋白運動單位[13]。許多趨化性細胞因子通過激活MLC 磷酸化來啟動遷移[13]。另外，MAPK 誘導(dǎo)的細胞遷移需要MLC 磷酸化[13]。本研究檢測到ABZ 處理后能夠顯著降低MLC 的磷酸化。之前的研究[8]顯示，CFL 在未刺激的VSMCs 中以磷酸化狀態(tài)存在，當(dāng)出現(xiàn)PDGF 激活后，其活性受去磷酸化作用的調(diào)節(jié)，從而使其能夠與遷移細胞的主要片狀脂膜上的F- 肌動蛋白結(jié)合影響VSMCs 的遷移。在本研究中，我們觀察到了CFL磷酸化水平在ABZ 處理的細胞中出現(xiàn)升高的現(xiàn)象。

本研究存在一些不足之處。在ABZ 對細胞增殖抑制的分子機制上，之前的研究顯示ABZ 能夠通過影響細胞周期蛋白復(fù)合物M 期促進因子（M-phase promoting factor，MPF）中Cdc2、cyclinA 及cyclin B 的磷酸化抑制細胞由G2期向M 期的轉(zhuǎn)化[9]，本研究并未進行檢測，可能需要在以后的研究中進一步明確。其次，有研究認為，在發(fā)生損傷的血管中，VSMCs 會出現(xiàn)表型轉(zhuǎn)化，其特征為收縮標(biāo)志物表達減少，同時增殖、遷移和細胞外基質(zhì)標(biāo)志物表達增加[14]。本研究中對血管的H-E 染色結(jié)果提示，VSMCs 在損傷血管中的增殖和遷移顯著增加。然而，在具體的分子信號機制中，仍需進一步探索。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，ABZ 通過影響細胞骨架蛋白上CFL 和MLC 的磷酸化，抑制VSMCs 遷移和內(nèi)膜增生。該結(jié)果提示，ABZ 可能是新內(nèi)膜增生和血管阻塞性疾病的重要治療藥物。

參·考·文·獻

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