賴丹昀，胡傳圣，祁 環(huán)，馬明亮，李 華，陶生策

1.上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院，系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200240；2.上海交通大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，上海200240

血清作為重要的生物樣品，其組成和濃度含有豐富的信息，能反映個(gè)體的健康狀況，為醫(yī)學(xué)診斷提供依據(jù)[1]。血清蛋白質(zhì)組學(xué)是血清研究的一個(gè)重要領(lǐng)域，即以血清為研究對(duì)象的蛋白質(zhì)組學(xué)，已成為尋找生物標(biāo)志物的有效手段。在血清的生物標(biāo)志物領(lǐng)域，除了差異表達(dá)蛋白和修飾異常蛋白之外，差異自身抗體的發(fā)現(xiàn)也有重要價(jià)值[2]。自身抗體，是識(shí)別自身抗原的抗體總稱，已被用于自身免疫性疾病和腫瘤等疾病標(biāo)志物研究[3-4]。從血清采集到檢測(cè)，不可避免地會(huì)出現(xiàn)長(zhǎng)短不同的時(shí)間間隔，血清中各組分往往因?yàn)闀r(shí)間滯后、保存條件差異等而出現(xiàn)不可預(yù)知的變化，可能導(dǎo)致不同程度的實(shí)驗(yàn)錯(cuò)誤，嚴(yán)重時(shí)可能出現(xiàn)假陰性和假陽性結(jié)果[5]。所以有效的血清質(zhì)控和質(zhì)量評(píng)估是非常必要的。已有的研究中，以全血樣品為目標(biāo)的有血細(xì)胞計(jì)數(shù)法[6]，而以血漿/血清樣品為目標(biāo)的方法則有基于質(zhì)譜技術(shù)的全局性分析[7-8]。但目前還沒有有效的方法來判斷血清中抗體的整體質(zhì)量。因此，我們希望建立一種高效的全局性評(píng)估策略，以評(píng)價(jià)血清樣品中抗體的質(zhì)量，這對(duì)于血清樣品的實(shí)驗(yàn)室保存、疾病隊(duì)列的建立等都有重要的意義。

噬菌體展示技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用已經(jīng)取得多項(xiàng)成果。噬菌體肽展示文庫（phage display peptide library）作為極為重要的資源之一，分為物種特異性肽文庫和隨機(jī)肽文庫。2010 年，首個(gè)人類蛋白質(zhì)組噬菌體肽展示文庫構(gòu)建成功，用于尋找疾病自身抗原[9]。隨后，利用物種特異性肽文庫的研究不斷涌現(xiàn)[10-11]。與物種特異性肽文庫相比，隨機(jī)肽文庫（如NEB 公司的Ph.D.-12）多樣性高達(dá)109數(shù)量級(jí)，與目標(biāo)蛋白結(jié)合時(shí)，沒有物種特異性肽文庫的偏好性[12]。聯(lián)合Ph.D.-12 噬菌體隨機(jī)肽展示文庫和高通量測(cè)序技術(shù)，我們已成功地篩選了系統(tǒng)性紅斑狼瘡的肽生物標(biāo)志物[13]，建立了高效且高通量的抗體識(shí)別表位解析技術(shù)[14]。香農(nóng)熵（Shannon entropy）經(jīng)常被用于表示組成某群體的個(gè)體多樣性及豐度[15]，在癌癥研究領(lǐng)域，熵可用于計(jì)算DNA 拷貝數(shù)畸變情況[16];熵還可用于與免疫系統(tǒng)相關(guān)數(shù)據(jù)分析，例如將熵值應(yīng)用于建立抗體獨(dú)特型網(wǎng)絡(luò)[17]?；陔S機(jī)肽庫的多樣性和無偏性，我們用香農(nóng)熵來表示樣品各自的肽結(jié)合模式，將復(fù)雜的個(gè)體情況轉(zhuǎn)換為數(shù)字形式，并對(duì)不同樣品進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，旨在初步建立一套能夠快速評(píng)價(jià)血清樣品中抗體整體質(zhì)量的量化指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

噬菌體隨機(jī)肽展示文庫Ph.D.-12、Q5 DNA 聚合酶（NEB，美國），無IgG 牛血清白蛋白（翊圣，中國），anti-6×His 抗體（Millipore，美國），Protein G 磁珠（Invitrogen，美國），膠回收純化試劑盒（諾唯贊，中國），96 孔聚苯乙烯板（百賽，中國）。Illumina 測(cè)序指定引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 血清樣品的制備 收集上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院臨床體檢的50 例健康者血清（臨床健康體檢報(bào)告中各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果均在參考范圍內(nèi)）。本研究得到了上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有參與者或監(jiān)護(hù)人已簽署知情同意書。每個(gè)樣品各取2 μL加入EP 管中混勻，作為標(biāo)準(zhǔn)樣品。將標(biāo)準(zhǔn)樣品分至20 個(gè)EP 管中，每個(gè)EP 管5 μL，將EP 管置于不同的溫度條件下：以-80 ℃為對(duì)照溫度；-20 ℃、4 ℃、37 ℃ 3 個(gè)溫度各設(shè)置3 個(gè)放置時(shí)間，分別為12、24、48 h；另設(shè)95 ℃孵育10 min 組。處理完畢后與噬菌體隨機(jī)肽展示文庫Ph.D.-12 進(jìn)行反應(yīng)。

1.2.2 血清結(jié)合噬菌體的分離 根據(jù)已發(fā)表的噬菌體文庫篩選相關(guān)報(bào)道[13]，對(duì)其方法進(jìn)行了簡(jiǎn)單修改。取96 孔板，每孔用200 μL 3%無IgG 牛血清白蛋白封閉，放置于4 ℃環(huán)境中振蕩過夜（12 ～16 h）。封閉完畢后棄封閉液，用TBST 緩沖液200 μL/孔清洗1 遍。向96 孔板中加入TBST 緩沖液90 μL/孔，隨后將已經(jīng)處理好的血清樣品依次加入96 孔板中，每孔加入1 μL 血清，每種樣品重復(fù)3 個(gè)復(fù)孔。在96 孔板上設(shè)置陽性對(duì)照（加入1 μL 的anti-6×His 抗體）和空白對(duì)照（不加入血清）。最后加入噬菌體隨機(jī)肽展示文庫10 μL/孔，將該體系置于4 ℃環(huán)境中振蕩過夜（12 ～16 h）。每孔加入10 μL 清洗過的Protein G 磁珠，4 ℃下振蕩4 h。使用TBST 緩沖液200 μL/孔清洗后將96 孔板置于磁力架，把磁珠以外的液體除盡，該步驟重復(fù)3 次，最后使用去離子水清洗1 次。向96 孔板中加入去離子水20 μL/孔重懸，即為Protein G 磁珠、IgG及其結(jié)合的噬菌體三者的復(fù)合物（圖1）。

圖1 噬菌體淘選流程圖Fig 1 Work flow of phage screening

1.2.3 高通量測(cè)序文庫構(gòu)建 根據(jù)已發(fā)表的噬菌體文庫篩選相關(guān)報(bào)道[13]，對(duì)其方法進(jìn)行了簡(jiǎn)單修改，具體流程：將上述得到的復(fù)合物，95 ℃加熱20 min 使噬菌體釋放出DNA，凍存于-20 ℃，待用。使用時(shí)通過96 孔磁力架固定磁珠，排槍吸取上清液作為第1 輪PCR 的模板。

用2 輪延伸PCR 法構(gòu)建高通量測(cè)序文庫，用Q5 熱啟動(dòng)DNA 聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列見表1。用于擴(kuò)增的引物序列中，標(biāo)記的序列代表由8 個(gè)核苷酸組成的編號(hào)序列，用于樣品的混合。第1 輪PCR 的總體系為25 μL，包括噬菌體DNA（擴(kuò)增模板）、1×Q5 緩沖液、100 μmol/L dNTP（ 脫氧核糖核苷三磷酸，deoxy-ribonucleoside triphosphate）、0.25 μmol/L 正 向 引 物（01-S502-23R 至12-S517-23R）、0.25 μmol/L 反向引物（01-N701-18 至11-N714-18）、Q5 聚合酶0.25 μL。PCR 反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共25 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min。PCR 結(jié)束后配制2.5%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證產(chǎn)物。按照試劑盒說明書從凝膠中回收產(chǎn)物。第2 輪PCR 的反應(yīng)體系為25 μL，包括第1 輪PCR擴(kuò)增后的膠回收產(chǎn)物1 μL 作為擴(kuò)增模板，1×Q5 緩沖液、0.25 μmol/L Index-S518 正向引物、0.25 μmol/L Index-N718反 向 引 物、100 μmol/L dNTP、Q5 聚 合 酶0.25 μL。PCR反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共10 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min。PCR 結(jié)束后配制2.5%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證產(chǎn)物，并回收產(chǎn)物。在測(cè)量濃度后，將核酸產(chǎn)物等量混合在一起。合并的文庫在Illumina HiSeq5000 平臺(tái)上以2×150 配對(duì)末端作為測(cè)序模式進(jìn)行測(cè)序。

表1 高通量測(cè)序相關(guān)引物序列Tab 1 Primers for next generation sequencing

Continued Tab

1.2.4 生物信息學(xué)分析 在噬菌體中插入的片段共103個(gè)堿基對(duì)，結(jié)構(gòu)見圖2。根據(jù)高通量文庫構(gòu)建過程中在核酸樣品兩端擴(kuò)增引入的標(biāo)簽（表1 中帶下劃線的序列）將所有讀出的多肽歸類至每個(gè)血清樣品中，核酸序列進(jìn)一步被翻譯為氨基酸序列。將一個(gè)樣品中每條多肽的數(shù)量除以該血清樣品中所有多肽的數(shù)量之和，乘100 000 作為歸一化后的數(shù)值，減去空白對(duì)照組的數(shù)值，得到最終一個(gè)樣品中每條多肽的讀數(shù)，取讀數(shù)排名前10 000 的多肽進(jìn)行后續(xù)分析。通過MEME 網(wǎng)站（http://meme-suite.org/tools/meme）對(duì)陽性對(duì)照組的4 個(gè)復(fù)孔anti-6×His 抗體的多肽序列進(jìn)行基序分析，以檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的可靠性。每個(gè)溫度處理?xiàng)l件下樣品的閾值都設(shè)在0.01 以上，將符合該條件的多肽進(jìn)行香農(nóng)熵的計(jì)算，公式為H =-∑p （x） ×log[p （x） ]，其中p （x）表示多肽x 的出現(xiàn)概率。

圖2 擴(kuò)增產(chǎn)物二代測(cè)序結(jié)構(gòu)圖Fig 2 Sequence structure of amplified product for next generation sequencing

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 陽性對(duì)照的motif 計(jì)算驗(yàn)證

為了檢測(cè)上述淘選實(shí)驗(yàn)的可靠性，我們采取具有已知結(jié)合表位的抗體anti-6×His 抗體作為陽性對(duì)照，陽性對(duì)照進(jìn)行了4 次重復(fù)，分散在96 孔板上的不同位置。淘選流程與血清樣品一致，經(jīng)二代測(cè)序?qū)⒏患氖删w中的核酸信息轉(zhuǎn)化為多肽信息后，通過在線Motif 模擬工具M(jìn)EME 進(jìn)行表位的發(fā)現(xiàn)[參數(shù)設(shè)置：-evt（篩選閾值）為0.001，-nepitopes（epitope 出現(xiàn)次數(shù)）為8，-minw（功能域長(zhǎng)度最小值）為6，-maxw（功能域長(zhǎng)度最大值）為10，其余參數(shù)為默認(rèn)值]。結(jié)果顯示4 個(gè)陽性對(duì)照識(shí)別的表位均與6×His 匹配，說明本實(shí)驗(yàn)操作流程是可靠的（圖3）。

2.2 實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性分析

為了驗(yàn)證淘選實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，將-80 ℃條件下的2 個(gè)血清樣品（80S1 和80S2）和陽性對(duì)照組的2 個(gè)樣品（80H1 和80H2）每條多肽的讀數(shù)經(jīng)歸一化處理后，進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析。最終血清重復(fù)實(shí)驗(yàn)和anti-6×His 抗體重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Pearson 相關(guān)系數(shù)r 分別為0.986 和0.976，說明淘選實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性較好（圖4）。

圖4 在多肽水平對(duì)血清樣品及陽性對(duì)照的淘選實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性分析Fig 4 Reproducibility of biopanning of serum sample and positive control on peptide level

2.3 極端溫度下香農(nóng)熵的變化

為了研究極端條件下血清的多樣性系數(shù)，并將此作為所有處理?xiàng)l件的極值，我們選擇能使蛋白質(zhì)變性的條件——95 ℃下孵育10 min。血清樣品處理后呈淡黃色沉淀，幾乎無殘留液體。經(jīng)過噬菌體淘選、二代測(cè)序、數(shù)據(jù)分析等過程，讀數(shù)大于0.01 的多肽數(shù)量相比-80 ℃保存的樣品明顯減少，香農(nóng)熵從3.45 降至3.20，2 組樣品間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.008）（圖5）。雖然95 ℃處理后的樣品抗體幾乎完全失活，但由于測(cè)序數(shù)據(jù)并不完全相同，減去空白對(duì)照后多肽仍有少量剩余，因而香農(nóng)熵并非完全為零。

圖5 95 ℃處理后血清樣品中IgG 識(shí)別多肽的多樣性Fig 5 Diversity of peptides recognized by antibodies in serum treated at 95 ℃

2.3 不同溫度對(duì)血清香農(nóng)熵的影響

為了探究血清樣品在不同溫度條件下香農(nóng)熵是否發(fā)生變化以及這些變化是否能用香農(nóng)熵進(jìn)行表征，我們將樣品在-20 ℃、4 ℃、37 ℃下分別處理12、24、48 h，并通過噬菌體淘選、二代測(cè)序、數(shù)據(jù)分析等過程，分別將各時(shí)間段樣品計(jì)算得到的香農(nóng)熵與-80 ℃條件下樣品的香農(nóng)熵進(jìn)行比較（-80 ℃在X 軸上標(biāo)示為“0”）。

其中，-20℃下處理不同時(shí)間的血清樣品，其香農(nóng)熵較-80℃未出現(xiàn)明顯變化。該結(jié)果表明，在凍存條件下，血清中抗體所識(shí)別的多肽的多樣性基本相同，抗體的結(jié)合能力保持穩(wěn)定。在4 ℃條件下處理的血清樣品在12 h 后，香農(nóng)熵呈下降趨勢(shì)，處理48 h 后從3.45 降至3.39。該結(jié)果表明，在4 ℃時(shí)，抗體的多樣性在12 h 內(nèi)已發(fā)生變化，抗體結(jié)合能力在12 h 內(nèi)開始下降。同樣地，樣品在37 ℃下放置12 h 后，香農(nóng)熵也呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，并且其下降幅度比4 ℃更大；處理48 h 后，香農(nóng)熵已降至3.32。該結(jié)果表明，在37 ℃時(shí)，抗體的多樣性在處理的12 h 內(nèi)已發(fā)生明顯變化，抗體結(jié)合能力在處理的12 h 內(nèi)開始較大程度地降低（圖6）。結(jié)合幾個(gè)溫度條件下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，香農(nóng)熵能夠表征血清抗體的結(jié)合能力。

圖6 不同溫度下血清樣品中IgG 識(shí)別多肽的多樣性變化趨勢(shì)Fig 6 Diversity trend of peptides recognized by antibodies in serum at different temperatures

3 討論

優(yōu)質(zhì)的臨床生物樣品是生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)、鑒定和確認(rèn)的關(guān)鍵。血液樣品加工和處理方式的變化會(huì)影響蛋白質(zhì)豐度和測(cè)定的可靠性[5]。對(duì)不同類型的血樣有不同的質(zhì)量檢查方法，如全血樣品各組分的分析方法，主要包括全細(xì)胞計(jì)數(shù)、綜合代謝分析，其中代謝分析中對(duì)蛋白質(zhì)和酶類的分析也僅限于已知蛋白質(zhì)（如血紅蛋白、白蛋白、堿性磷酸酶等）[6]。血樣中蛋白相關(guān)生物標(biāo)志物以蛋白質(zhì)為主。蛋白質(zhì)相關(guān)生物標(biāo)志物主要有2 種：①基于豐度和修飾改變的蛋白質(zhì)標(biāo)志物。②基于抗體變化，尤其是自身抗體改變的生物標(biāo)志物。對(duì)前者已有了相關(guān)的質(zhì)控手段[1]，但對(duì)后者則嚴(yán)重欠缺。

本文采用高效方便的噬菌體展示技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)，將不同溫度下貯存的血清與噬菌體隨機(jī)肽展示文庫進(jìn)行反應(yīng)，通過免疫沉淀法捕捉噬菌體與IgG 的多肽復(fù)合物，在高溫條件下獲取噬菌體內(nèi)的核酸后擴(kuò)增進(jìn)行二代測(cè)序，最后轉(zhuǎn)換成每個(gè)樣品中IgG 識(shí)別的多肽信息。經(jīng)歸一化、減去空白對(duì)照后，保留出現(xiàn)頻率大于0.01 的多肽，以全面評(píng)價(jià)血清中抗體的結(jié)合能力。經(jīng)多樣性分析，在-80 ℃與-20 ℃這2 種相似的凍存狀態(tài)處理12、24、48 h 后，多肽的多樣性沒有明顯變化，這與已有報(bào)道[18]的全血樣品蛋白質(zhì)組的變化情況一致。但當(dāng)溫度分別為4 ℃、37 ℃時(shí)，其多樣性在12 h 內(nèi)呈下降趨勢(shì)，且并隨著時(shí)間變化逐漸接近極端條件。因此，我們認(rèn)為香農(nóng)熵有潛力成為評(píng)價(jià)血清中抗體質(zhì)量的指標(biāo)，以及將噬菌體展示技術(shù)與高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合起來用于評(píng)價(jià)血清質(zhì)量具備可行性，而且整個(gè)血清樣品的狀態(tài)還可通過抗體水平的結(jié)合能力來評(píng)價(jià)。

同時(shí)，我們認(rèn)為現(xiàn)行的評(píng)估體系可以得到進(jìn)一步改進(jìn)。第一個(gè)問題是樣品的設(shè)計(jì)，可以進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的處理，使多樣性的變化趨勢(shì)更加明顯以及處理時(shí)間達(dá)到多久時(shí)樣品的香農(nóng)熵會(huì)達(dá)到極端值，這將指導(dǎo)后續(xù)實(shí)驗(yàn)樣品的存儲(chǔ)和實(shí)驗(yàn)隊(duì)列的建立。第二，數(shù)據(jù)分析應(yīng)從更多方面進(jìn)行。一方面，測(cè)序通量大小引起的多肽數(shù)目的多少，本次實(shí)驗(yàn)選取的1 萬條多肽較文獻(xiàn)[15]報(bào)道的少，因此可以擴(kuò)大測(cè)序通量選擇的范圍，以擴(kuò)大香農(nóng)熵的評(píng)估庫容量。另一方面，即空白對(duì)照的選取。95 ℃處理后，血清的真實(shí)狀態(tài)與空白對(duì)照比較接近，但由于二代測(cè)序后不同樣品的讀數(shù)并不完全相同，所以在減去空白對(duì)照后，95 ℃樣品的多肽讀數(shù)雖然接近于0，但仍可作為多樣性分析的輸入，香農(nóng)熵也因此不是0。所以在數(shù)據(jù)分析中選擇閾值也值得進(jìn)一步探討。由于血清中有多種IgG，結(jié)合的肽序列復(fù)雜，不能獲得顯著的motif，因此與單抗的質(zhì)檢對(duì)比缺少了表位這一評(píng)估特征。盡管香農(nóng)熵已被證明具有評(píng)價(jià)血清中抗體質(zhì)量的潛力，但血清中含有的抗體比單抗復(fù)雜得多，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)改進(jìn)時(shí)，可以擴(kuò)大其范圍，增加其他的參數(shù)，從多個(gè)方面對(duì)血清的抗體質(zhì)量進(jìn)行綜合 評(píng)價(jià)。

綜上所述，我們首次將噬菌體展示技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)聯(lián)合起來，利用香農(nóng)熵對(duì)血清中抗體的質(zhì)量進(jìn)行表征，建立了一套通用性強(qiáng)，易于擴(kuò)展，通量高，適用于全血清抗體質(zhì)量控制的初步評(píng)價(jià)體系。

參·考·文·獻(xiàn)

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