黃世明，楊 洋，尹 亮，岳建蘭，林志春

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占80%，其中肺腺癌是NSCLC最常見的病理類型，有70%的肺腺癌患者發(fā)現(xiàn)時已為中晚期，導(dǎo)致治療效果欠佳，5年生存率僅為17%[1,2]。近年來，對NSCLC分子生物學(xué)的相關(guān)研究促進(jìn)了分子靶向藥物治療的進(jìn)展，酪氨酸激酶抑制藥(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)已成為治療表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因突變患者的有效方法，因此EGFR基因突變狀態(tài)也是預(yù)測EGFR-TKIs治療療效的主要因素[3,4]。研究表明，NSCLC的電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(computed tomography，CT)影像特征、正電子發(fā)射斷層顯像計(jì)算機(jī)斷層掃描(positron emission tomography/computed tomography， PET/CT)代謝參數(shù)與基因突變之間存在相關(guān)性[5]，其中肺部CT特征對肺癌EGFR的突變有預(yù)測作用[6]，而18F氟代脫氧葡萄糖(18-fluoro deoxy glucose，18F-FDG)PET/CT可同時反映病灶的代謝、功能等分子影像數(shù)據(jù)以及PET/CT解剖學(xué)信息，具有高靈敏性、高特異性、空間定位準(zhǔn)確等特點(diǎn)[7]。因此，本研究將探討18F-FDG PET/CT代謝參數(shù)聯(lián)合腫瘤標(biāo)志物對肺腺癌EGFR基因突變的預(yù)測價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2010-01至2018-08在武警特色醫(yī)學(xué)中心經(jīng)PET/CT檢查診斷為原發(fā)性肺癌的105例患者，并經(jīng)病理學(xué)(通過支氣管鏡、穿刺活檢或手術(shù)切除取得組織標(biāo)本)確診為肺腺癌的患者。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)組織病理證實(shí)為肺腺癌；(2)在腫瘤治療前行18F-FDG PET/CT檢查及腫瘤標(biāo)志物檢測；(3)進(jìn)行EGFR基因突變檢測；(4)無其他腫瘤病史；(5)患者及家屬簽署知情同意書，依從性較好。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床資料缺失；(2)確診為轉(zhuǎn)移性腺癌；(3)合并其他肺部慢性疾病，如肺結(jié)核、COPD及肺部慢性職業(yè)病等。

1.2 EGFR基因檢測方法使用 目前，較為廣泛采用擴(kuò)增受阻突變系統(tǒng)法(amplification refractory mutation system，ARMS-PCR)檢測EGFR熱點(diǎn)突變基因(18-21外顯子)的突變情況[8]。將手術(shù)或病理穿刺取出的肺癌組織用福爾馬林進(jìn)行固定、石蠟包埋，使用DNA提取試劑盒提取足量的DNA樣本，所有DNA樣本經(jīng)分光光度計(jì)(美國Thermo Scientific公司)濃度檢測達(dá)到50 mg/L即為合格樣本，合格的DNA樣本經(jīng)ARMS-PCR擴(kuò)增后再進(jìn)行測序分析。所有步驟均按照說明書進(jìn)行檢測。

1.3 PET/CT檢查及數(shù)據(jù)采集 采用美國GE公司 PET/CT(Discovery ste16型)掃描儀采集圖像，注射18F-FDG (3.70～5.55 MBq/kg)后進(jìn)行PET/CT掃描。CT的掃描范圍由顱頂掃描至股骨，層厚3.75 mm；PET采用3D采集并行重建技術(shù)，采集時間為3 min/床位，所有圖像的重建及融合由工作站(AW4.4)進(jìn)行。

1.3.1 分析CT影像學(xué)特征 由兩位副主任醫(yī)師共同分析肺腺癌病灶的影像特征[9]，共包括16項(xiàng)：(1)病灶的基本影像學(xué)征象4個，病灶分布(中央型或周圍型)、形態(tài)和密度；(2)病灶內(nèi)部特征6個，空泡及空洞、鈣化、充氣支氣管征、液化壞死、分葉征、毛刺征；(3)病灶相關(guān)的其他特征6個，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、縱隔或肺門淋巴結(jié)增大、肺內(nèi)轉(zhuǎn)移、肺氣腫、胸膜凹陷征和胸腔積液。

1.3.2 SUV的采集 采用上海杏翔工作平臺操作軟件AW 4.4患者肺部病灶進(jìn)行感興趣區(qū)(Region of interest，ROI)勾畫，自動獲得病灶標(biāo)準(zhǔn)攝取值(standard uptake value,SUV)的最大值(SUVmax)與平均值(SUVmean)。

1.3.3 病灶糖代謝體積(metabolic tumor volume， MTV)和病灶總糖代謝量(total lesion glycolysis，TLG)的采集 分別對肺癌PET/CT圖像進(jìn)行分析，設(shè)定絕對閾值為SUV40%，對病灶進(jìn)行冠狀面手動選取病灶范圍，自動得出MTV值，單位mm3；TLG為MTV與SUVmean的乘積(TLG=MTV×SUVmean)。

1.4 腫瘤標(biāo)志物的測定 患者均清晨空腹采集靜脈血5 ml，采用EDTA-K2處理，在抗凝后的2 h內(nèi)完成NSE、CYFRA21-1及CEA血液水平的檢測，采用美國貝克曼公司的庫爾特UniCelDxI 600免疫分析儀對NSE、CYFRA21-1及CEA進(jìn)行檢測。

1.5 建立EGFR基因突變預(yù)測模型并評價其診斷效能 根據(jù)患者的臨床資料、影像學(xué)檢查資料和實(shí)驗(yàn)室檢查資料，通過logistic回歸建立臨床EGFR基因突變預(yù)測模型。采用R軟件對模型的自變量數(shù)據(jù)和因變量數(shù)據(jù)(EGFR基因突變)進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理，對模型研究對象的各指標(biāo)計(jì)分評估，并依據(jù)總評分對應(yīng)的疾病風(fēng)險值得出最終EGFR突變風(fēng)險概率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 14.0和R軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，先進(jìn)行單因素logistic分析，保留有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)的影響因素，再行多因素分析，再將多因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)的因素納入預(yù)測模型，建立對EGFR突變的多因素預(yù)測數(shù)學(xué)模型。通過R軟件制作列線圖，將有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的影響因素和因變量數(shù)據(jù)(EGFR基因突變)進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理。根據(jù)ROC曲線，計(jì)算其Cutoff值，對比模型間AUC值，得出預(yù)測效能最高的EGFR基因突變預(yù)測模型。

2 結(jié) 果

2.1 基本臨床資料 最終納入肺腺癌患者105例，EGFR突變型32例，EGFR野生型73例，其中男48例，女57例，年齡38～85歲，平均(63.0±11.1)歲。統(tǒng)計(jì)分析顯示，EGFR野生型組和EGFR突變型組的性別和吸煙史因素差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而年齡、臨床分期、高血壓、糖尿病及確診方式差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 兩種類型肺腺癌患者的臨床基本特征 (n;%)

2.2 CT影像學(xué)特征與EGFR突變的關(guān)系 通過卡方檢驗(yàn)結(jié)果顯示，EGFR野生型組和EGFR突變型組CT影像特征中的病灶密度、毛刺征與病灶遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而兩組病灶的分布、形態(tài)、空洞及空泡等其他13項(xiàng)CT特征之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表2 兩種類型肺腺癌患者的CT影像學(xué)特征 (n;%)

2.3 PET/CT代謝參數(shù)與EGFR突變的關(guān)系 通過獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示EGFR野生型組與突變型組的PET/CT代謝參數(shù)SUVmax、Mean、MTV和TLG分別為8.68±4.66、6.34±3.85、74.06±55.63、456.47±490.71與7.11±4.08、4.49±2.71、71.24±83.09、390.12±651.15，其中兩組之間的SUVmax、MTV和TLG無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.088、0.861、0.608)，而SUVmean差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.82，P=0.015)。

2.4 腫瘤標(biāo)志物與EGFR突變的關(guān)系 EGFR野生型組與突變型組之間的腫瘤標(biāo)志物：CEA具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.48，P=0.016)，而CYFRA21-1和NSE之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值分別為0.481、0.422)。

2.5 患者特征數(shù)據(jù)與EGFR基因突變的單因素和多因素logistic分析 對上述影響肺腺癌患者的EGFR基因突變的因素采用二分類logistics回歸進(jìn)一步分析(包括性別、吸煙、PET/CT代謝參數(shù)、腫瘤標(biāo)記物、密度、毛刺征、肺內(nèi)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)，結(jié)果顯示性別(P=0.019)、吸煙(P=0.035)、CEA(P=0.025)、密度(P=0.018)、毛刺征(P=0.008)、肺內(nèi)轉(zhuǎn)移(P=0.004)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而SUVmeanP=0.070，但由于SUVmean是本研究的重要影響因素，P值擴(kuò)大至0.1，也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，均是預(yù)測EGFR突變的獨(dú)立影響因素。

2.6 建立模型的可視化列線圖 通過logistic回歸建立4個臨床EGFR基因突變預(yù)測模型，進(jìn)一步分析顯示，4個預(yù)測模型均具有預(yù)測的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Model1- 4的診斷百分比分別為78.1%、81.0%、78.1%、81.9%，Model 4的準(zhǔn)確性最高。而SUVmean、CEA對EGFR突變預(yù)測能力的ROC曲線數(shù)據(jù)分析顯示：SUVmean的cutoff值為4.91，其AUC值為0.612，SE(95%CI)=0.0582(0.512-0.706)，敏感度為62.50%，特異度為61.64%；CEA的cutoff值為7.18，其AUC值為0.666，SE(95%CI)=0.0553(0.567-0.755)，敏感度為78.12%，特異度為53.42%。而對四個模型將采集的數(shù)據(jù)集進(jìn)行預(yù)測(四個模型的ROC曲線見圖1)，結(jié)果顯示，Model 4對EGFR基因突變的預(yù)測能力最強(qiáng)，AUC為0.860。

圖1 四種模型對EGFR突變預(yù)測能力的ROC曲線數(shù)據(jù)分析

3 討 論

肺癌是最常見的癌癥之一，對于早期肺癌，手術(shù)切除是最好的治療方法，而對于晚期無法切除的肺癌患者，目前主要是進(jìn)行放化療，但不良反應(yīng)較大[10]。隨診分子腫瘤學(xué)的不斷發(fā)展，肺癌的分子靶向治療已得到廣泛的臨床應(yīng)用，而EGFR基因的突變是肺癌中第一個被發(fā)現(xiàn)可用于預(yù)測NSCLC靶向治療療效的生物標(biāo)記物[11]。臨床研究發(fā)現(xiàn)不吸煙、女性、亞裔及肺腺癌患者是EGFR-TKIs治療的優(yōu)勢人群，即上述人群EGFR基因突變率比其他人群高[12]。

本研究結(jié)果顯示，與EGFR基因突變有關(guān)的單因素影響因子包括吸煙、性別、SUVmean、密度、毛刺征、肺內(nèi)轉(zhuǎn)移、CEA，即非吸煙患者與女性患者的EGFR突變率更高，該結(jié)果與大部分研究結(jié)果一致[13, 14]，但目前性別的影響原因還不十分清楚，而根據(jù)以往對雌激素的研究推測，雌激素可能具有致癌性，例如，女性肺腺癌患者在絕經(jīng)前其肺癌更具侵襲性[15]。而在在移植肺腺癌細(xì)胞株的小鼠模型中，吉非替尼和雌激素受體拮抗劑存在協(xié)同效應(yīng)，證明雌激素受體與EGFR糖蛋白通路可能存在相互作用，但是性別因素對EGFR突變的影響機(jī)制仍需進(jìn)一步研究[16]。

在PET/CT代謝參數(shù)及CT影像征象方面，目前還沒有一致性結(jié)果，本研究結(jié)果顯示PET/CT代謝參數(shù)中SUVmean小于4.91患者的EGFR突變率高以及CT影像征象中出現(xiàn)部分實(shí)性密度、毛刺征、肺內(nèi)轉(zhuǎn)移的患者的EGFR突變率高。Yip等[17]發(fā)現(xiàn)SUVmax等PET代謝參數(shù)對肺腺癌的EGFR、KRAS突變有預(yù)測作用。張亞銳等[18]發(fā)現(xiàn)肺癌原發(fā)病灶的SUVmax<8.8組對EGFR突變預(yù)測的敏感度明顯高于SUVmax≥8.8組(71%對比20%，P<0.001)。另有研究發(fā)現(xiàn)，SUVmax越高對EGFR突變預(yù)測的敏感度越高，研究的差異可能由于各個研究的SUVmax的影響因素較多，如：患者血糖水平，PET儀器型號批次、人種、圖像采集操作時間等差異[19]。

血清腫瘤標(biāo)志物與EGFR突變的相關(guān)聯(lián)系目前還處于研究階段，研究結(jié)論也不統(tǒng)一。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤標(biāo)志物中CEA高于7.18 ng/ml的患者EGFR突變率高。也有研究表明治療前NSCLC的腫瘤標(biāo)志物CEA水平可以預(yù)測EGFR-TKIs治療，其中Jung[20]等發(fā)現(xiàn)在NSCLC中EGFR突變與腫瘤組織CEA水平呈正相關(guān)(P=0.021)。也有研究發(fā)現(xiàn)Cyfra21-1和CEA的升高是基因EGFR突變和EGFR-TKIs獨(dú)立的預(yù)測和預(yù)后因素[21]。有學(xué)者認(rèn)為，EGFR突變與 CEA升高相關(guān)，可能由于EGFR基因突變導(dǎo)致下游某傳導(dǎo)通路被激活，從而促進(jìn)了機(jī)體抗凋亡發(fā)生，導(dǎo)致血清CEA蛋白的激活，致使血清CEA升高[22]。因此，對于EGFR突變的預(yù)測，單一的代謝參數(shù)不具有足夠的說服力，需要結(jié)合多個獨(dú)立影響因素建立EGFR突變預(yù)測模型更具準(zhǔn)確性[23]。因此，本研究利用患者的臨床基本信息、肺腺癌PET/CT代謝參數(shù)及其CT影像學(xué)特征、腫瘤標(biāo)志物對EGFR突變的預(yù)測能力建立logistic預(yù)測回歸模型，其中模型4的診斷能力最高，即根據(jù)模型4只要分析患者的性別、吸煙情況、病灶密度、是否有毛刺征、是否有肺內(nèi)轉(zhuǎn)移、SUVmean值及CEA值，可有助于臨床分析判斷患者是否發(fā)生EGFR基因突變。

本研究不足之處: (1)本研究為單中心研究，所以納入病例量較小，且并非所有肺腺癌患者都會在術(shù)前行PET/CT檢測，此研究不能準(zhǔn)確代表整體肺腺癌人群情況；(2)本研究為回顧性研究，并且數(shù)據(jù)資料收集繁瑣，沒有將研究結(jié)果進(jìn)行前瞻性研究來驗(yàn)證其有效性；(3)本研究中的MTV代謝參數(shù)的勾畫為圖像處理工作站(AW4.4)自帶軟件SUV2.5為閾值進(jìn)行自動勾選計(jì)算，與其他研究所采用SUVmax的閾值分割標(biāo)準(zhǔn)存在一定的區(qū)別，期采用多樣SUV標(biāo)準(zhǔn)采集MTV，對比研究發(fā)現(xiàn)最佳SUV閾值；(4)由于腫瘤易發(fā)生肺部及遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，在采集原發(fā)病灶代謝參數(shù)及CT特征時，本研究只采集原發(fā)病灶的特征性參數(shù)，對于肺內(nèi)轉(zhuǎn)移較多，排除了不易分辨原發(fā)病灶的病例，造成了病例納入的選擇偏移；(5)本研究對肺部的16個CT特征進(jìn)行提取，僅篩選出個別特征對EGFR突變具有預(yù)測能力的參數(shù)，由于CT特征為人工提取(由2名PET/CT專業(yè)醫(yī)師分別評判提取)，存在評判誤差可能。

綜上所述，與EGFR基因突變有關(guān)的單因素影響因子包括吸煙、性別、SUVmean、密度、毛刺征、肺內(nèi)轉(zhuǎn)移、CEA，而根據(jù)這些影響因子建立的預(yù)測模型4將有助于臨床分析肺癌患者是否發(fā)生EGFR基因的突變，從而指導(dǎo)臨床進(jìn)行靶向藥物的個體化治療。