宋昱，方策，2，馬飛，張初署，于麗娜，畢潔，王明清，于淼，遲曉元，張建成，孫杰，江晨

（1.山東省花生研究所，山東 青島 266100；2.山東師范大學，山東 濟南 250014；3.中國農業(yè)科學院油料作物研究所，湖北 武漢 430062；4.遼寧省農業(yè)科學院食品與加工研究所，遼寧 沈陽 110161）

花生屬于油料作物，它作為重要創(chuàng)匯農產品和具有很強國際競爭力的大型農產品［1］，近年來在國內市場和世界貿易中的地位及影響力一直處于上升狀態(tài)［2］。我國花生產量及出口量從2000年以來一直穩(wěn)居前列［3］?；ㄉ谵r產品經濟和貿易中的地位十分重要［4-6］。

花生衣是花生的種皮，具有止血、化瘀、消腫等功效。它主要由蛋白質、纖維素、脂肪、灰分以及少量單寧、色素等物質組成［7-9］?；ㄉ潞卸喾N活性成分，其中引起較多關注的是原花青素［10］。

原花青素（proanthocyanidin，PC）廣泛存在于很多植物中，其基本結構是有C6-C3-C6骨架，具有水溶性、醇溶性、無毒無過敏性。PC屬于酚類物質，主要由兒茶素單體、表兒茶素單體、表兒茶素沒食子酸酯單體、沒食子酸單體、原花青素B1、原花青素B2以及由單體通過C4-C6鍵、C6-C8鍵結合而形成的低聚體、高聚體等組合而成的混合物。原花青素具有很好的功能活性［11］，能夠抑制腫瘤、改善人體微循環(huán)、抗炎、抑制血小板凝聚及脂質過氧化，還能提高人體免疫力、預防紫外線輻射、抗衰老、抗疲勞、抗基因突變、保護心血管等［9，12-21］。PC還可通過抑制葡萄糖苷酶、淀粉酶、蛋白-酪氨酸磷酸酶等起到預防糖尿病的作用［22］；也可通過抑制乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿脂酶、淀粉樣前體蛋白裂解酶來抑制淀粉樣肽的自我聚集，可提高突觸的可塑性以及改善大腦血流，提高血漿的還原能力［23］。因此原花青素可以被開發(fā)成防治心腦血管的藥物、天然的抗氧化劑以及綠色化妝品等［14，24］。國外以葡萄籽中原花青素作為主要活性成分的藥品或者食品的營養(yǎng)補充劑已經深入人們的日常生活［25，26］，而國內對這類產品的開發(fā)才剛剛起步，但發(fā)展勢頭很好，目前有不少企業(yè)正在著手這一類產品的研發(fā)以及生產［2，27，28］。

將花生衣中的原花青素提取出來作為藥物或者食品中的有效成分，是近年來研究的熱點。我國是花生生產大國，花生衣作為花生加工后的主要副產物，每年都會有幾十萬噸的產量。將花生衣作為提取原花青素的來源，不僅是對加工副產物的有效利用，而且還能帶來經濟利益。從原料方面來說，花生衣的來源廣且價格低，具有成本低的突出特點；從提取工藝來說，它操作簡便，儀器與試劑較易獲得，最終的提取率較高；從市場方面來說，它符合我國新時代的發(fā)展模式，具有很好的應用前景。本試驗以白玉花生、黑花生2號及花育23為材料，研究不同品種、不同種皮顏色、不同生長時期花生衣中的原花青素含量、組成及抗氧化活性，以期為花生衣高活性原花青素提取及進一步應用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

2019年7—8月在山東省花生研究所萊西試驗站獲取白玉花生、黑花生2號及花育23各品種花生下針后30天和50天的花生衣。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，SIGMA-ALDRICH）和三羥甲基氨基甲烷（Tris，SIGMA-ALDRICH）及對照品兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、沒食子酸、原花青素B1、原花青素B2等，均購自北京索萊寶科技有限公司；甲醇、乙腈、四甲基乙二胺為色譜級試劑，其余均為國產分析純試劑。

1.2 主要儀器與設備

主要有：紫外分光光度計（尤尼柯上海儀器有限公司產品）；HPLC-1260高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司產品）；真空冷凍干燥機（美國西盟國際金西盟儀器有限公司產品）；循環(huán)水式多用真空泵（上海知信試驗儀器技術有限公司產品）；Centrifuge 5430R高速離心機（德國Eppendorf公司產品）。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同品種花生衣原花青素提取 將白玉花生、黑花生2號、花育23各品種花生下針生長30天和50天的花生衣樣品分別命名為白花生3、黑花生3、花育23（3）和白花生5、黑花生5、花育23（5）。分別取各樣品2 g放入研缽中研磨30 min，按照1∶5的料液比加入80%乙醇，于40℃超聲波處理20 min，將濾渣再重復提取2次，之后濾液混合定容到50 mL。取粗提液各0.5 mL，用80%乙醇稀釋4倍，供后續(xù)試驗使用。

1.3.2 原花青素含量測定 具體方法如下。

（1）原花青素標準曲線制作：稱取原花青素標準品10 mg用80%乙醇溶解，然后定容于10 mL棕色容量瓶中，得到1 mg/mL原花青素乙醇標準液，然后稀釋至0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL濃度梯度。分別取0.5 mL放入試管中，加入4%香草醛甲醇溶液3 mL，混勻，再加入濃鹽酸1.5 mL，徹底混勻，室溫下顯色15 min左右，于500 nm波長下測定吸光度，記錄數(shù)據(jù)制作標準曲線［29-33］。

（2）原花青素含量測定：按照上述原花青素含量測定方法即香草醛-鹽酸法測定6個樣品的吸光度值，每個樣品平行測3次。

1.3.3 不同品種花生衣原花青素組分HPLC分析 具體方法如下。

（1）色譜分析條件：色譜柱為kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5μm），柱溫30℃；流動相為0.3%磷酸-乙腈（9∶1，V/V），流速0.7 mL/min，進樣量10μL，檢測波長278 nm。測定峰面積并帶入標準曲線方程中計算各待測液的原花青素含量。

（2）花生衣樣品液的組分測定：用針管吸取樣品液0.4 mL，0.22μm微孔濾膜（有機相）過濾到1.5 mL棕色小瓶中，上樣分析。

1.3.4 抗氧化活性測定 具體方法如下。

（1）不同品種花生衣原花青素DPPH自由基清除試驗：取上述6種提取物的稀釋液各0.5 mL分別放于EP管中，均加入4.5 mmol/L DPPH溶液0.5 mL，充分混勻，室溫下反應20 min，于波長517 nm處測定吸光度，空白對照組以0.5 mL蒸餾水代替待測液，每個樣品重復測定3次［34］。按照以下公式計算樣品對自由基的清除率：

清除率（%）＝［1-（Ai-Aj）/Ao］×100 。

式中，Ai為樣品與DPPH混合液吸光度；Aj為樣品與無水乙醇混合液吸光度；Ao為DPPH與無水乙醇混合液吸光度。

（2）不同品種花生衣原花青素羥自由基清除試驗：取上述6種提取物的稀釋液各0.25 mL分別放于EP管中，均加入6 mmol/L七水合硫酸亞鐵0.25 mL，充分混勻，再加入6 mmol/L水楊酸液0.25 mL及6 mmol/L過氧化氫0.25 mL，混合均勻后37℃水浴加熱1 h，再于波長510 nm處測定吸光度，對照組以0.25 mL蒸餾水代替待測液，每個樣品重復測定3次［35］。按照以下公式計算樣品對自由基的清除率：

清除率（%）＝［1-（Am-An）/Ap］×100 。

式中，Am為樣品與FeSO4、H2O2混合液吸光度；An為樣品與FeSO4、蒸餾水混合液吸光度；Ap為蒸餾水與FeSO4、H2O2混合液吸光度。

（3）不同品種花生衣原花青素超氧陰離子自由基清除試驗：取上述6種提取物的稀釋液各0.5 mL分別放于EP管中，加入50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.2）緩沖液1.25 mL，25℃水浴保溫20 min后，加入25 mmol/L鄰苯三酚溶液0.5 mL，5 min后加入10 mol/L HCl溶液0.5 mL，于320 nm處測定吸光度，空白對照組以0.5 mL蒸餾水代替待測液，每個樣品重復測定3次［36］。按照以下公式計算樣品對自由基的清除率：

清除率（%）＝［1-（Ah-Ak）/Aq］×100 。式中，Ah為樣品與Tris-HCl、鄰苯三酚、HCl混合液吸光度；Ak為樣品與Tris-HCl、蒸餾水、HCl混合液吸光度；Aq為蒸餾水與Tris-HCl、鄰苯三酚、HCl混合液吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel處理數(shù)據(jù)與作圖。

2 結果與分析

2.1 不同品種花生衣原花青素含量的確定

2.1.1 原花青素標準曲線的確定 原花青素含量標準曲線如圖1所示，其線性方程為y＝1.772x+0.0082（R2＝0.9989）。

圖1 原花青素標準曲線

2.1.2 不同品種及生長時期花生衣的原花青素含量 由表1可知，白玉花生、黑花生2號、花育23花生下針后30天，其PC含量表現(xiàn)為花育23＞黑花生2號＞白玉花生；下針后50天，白玉花生、黑花生2號、花育23花生衣的PC含量均提高，且仍以花育23最高，達0.234 g/g，白玉花生最低，僅為0.003 g/g。與30天時相比，3個品種花生衣的PC含量表現(xiàn)為分別提高1.50、3.41倍和3.20倍。

表1 不同品種花生衣的原花青素含量

2.2 不同品種花生衣的原花青素組分分析

2.2.1 原花青素標準品的HPLC圖譜 原花青素B1、原花青素B2、表兒茶素、兒茶素、沒食子酸和表兒茶素沒食子酸酯共6個標準品的HPLC圖譜如圖2所示。其標準曲線的線性方程為：（a）y＝5503.7x+19.567（R2＝0.9999）；（b）y＝5116.8x+29.466（R2＝0.9997）；（c）y＝6467.6x-4.0575（R2＝0.9986）；（d）y＝7103.2x+58.962（R2＝0.9983）；（e）y＝5607.5x+25.147（R2＝0.9981）；（f）y＝6829.1x+27.613（R2＝0.9989）。

圖2 原花青素B1（a）、原花青素B2（b）、表兒茶素（c）、兒茶素（d）、沒食子酸（e）和表兒茶素沒食子酸酯（f）標準品的HPLC圖譜

2.2.2 不同品種花生衣原花青素提取液組分測定結果 根據(jù)3個品種花生衣PC提取液結果（圖3）及其標準品HPLC圖譜（圖2）進行分析，可知，白花生3 PC提取液中含有沒食子酸和原花青素B1單體，其中沒食子酸含量為0.134 mg/g，原花青素B1含量為0.0746 mg/g；黑花生3 PC提取液中含有原花青素B2和沒食子酸單體，其中原花青素B2含量為0.0344 mg/g，沒食子酸含量為0.164 mg/g；花育23（3）PC提取液中含有兒茶素、沒食子酸、表兒茶素及表兒茶素沒食子酸酯等單體，其中兒茶素含量為0.117 mg/g，沒食子酸含量0.169 mg/g，表兒茶素含量為0.209 mg/g，表兒茶素沒食子酸酯含量為0.0548 mg/g；白花生5 PC提取液中含有沒食子酸單體，其含量為0.169 mg/g；黑花生5 PC提取液中含有原花青素B2、沒食子酸、表兒茶素、兒茶素及表兒茶素沒食子酸酯等單體，其中原花青素B2含量為0.593 mg/g，兒茶素含量為0.0808 mg/g，表兒茶素含量為0.150 mg/g，沒食子酸含量為0.113 mg/g，表兒茶素沒食子酸酯含量為0.369 mg/g；花育23（5）PC提取液中含有沒食子酸、表兒茶素、兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯等單體，其中兒茶素含量為1.302 mg/g，表兒茶素含量為0.316 mg/g，沒食子酸含量為0.0272 mg/g，表兒茶素沒食子酸酯含量為0.182 mg/g。根據(jù)以上結果可知，50天時各品種花生衣中PC單體的種類和含量與30天時具有明顯差異，其中黑花生5含單體種類最多，花育23（5）單體含量最高，而白玉花生花生衣中PC的單體種類和含量均不如其它兩個品種。

圖3 白花生3（a）、黑花生3（b）、花育23（3）（c）、白花生5（d）、黑花生5（e）和花育23（5）（f）PC提取液的HPLC圖譜

2.3 抗氧化活性研究

2.3.1 不同品種花生衣原花青素清除DPPH自由基效果 由圖4可知，所有品種花生衣PC提取液對DPPH自由基均具有一定的清除能力，但其清除能力不同。黑花生和花育23花生衣PC提取液的清除能力相對于白花生較強，其中清除能力最強的是花育23（5），達87.72%；清除能力最弱的是白花生3，僅為11.26%。表明，種皮顏色較深的黑花生和花育23其花生衣PC提取物清除DPPH自由基的能力優(yōu)于顏色較淺的白花生；隨生育時間延長，3個品種花生衣PC清除DPPH自由基的能力均有提高。該結果與2.1.2原花青素含量測定結果一致。相關研究表明，原花青素清除DPPH自由基能力的強弱與含量呈正相關，濃度越大，清除效果越明顯［37］。

圖4 PC提取液清除DPPH自由基能力

2.3.2 不同品種花生衣原花青素清除羥自由基效果 由圖5可知，白花生3、黑花生3、花育23（3）和白花生5、黑花生5、花育23（5）花生衣PC提取液清除羥自由基的效果均較好，最強的是花育23（5）花生衣PC提取液，高達84.61%，最弱的是白花生3僅為42.40%。隨生育時間延長，3個品種花生衣PC提取液清除羥自由基的能力均有提高。綜合看，各品種花生衣PC提取液清除羥自由基能力：花育23＞黑花生＞白玉花生。

圖5 PC提取液清除羥自由基能力

2.3.3 不同品種花生衣原花青素清除超氧陰離子自由基效果 由圖6可知，白花生3、黑花生3、花育23（3）和白花生5、黑花生5、花育23（5）花生衣PC提取液對超氧陰離子自由基均具有一定的清除能力，但不同品種和生育時間對其清除能力影響較大。其中清除效果最好的是花育23（5），高達93.86%；清除效果最差的是白花生3，只有7.69%。隨著生育時間延長，下針后50天3個品種花生衣PC提取液清除超氧陰離子自由基的能力均優(yōu)于30天的樣品。相關研究表明，原花青素可以通過抑制鄰苯三酚在堿性條件下的自氧化而實現(xiàn)超氧陰離子自由基（）的清除，并且其清除能力強弱同樣與含量呈正比，本試驗結果與其測定結果一致［34］。

圖6 PC提取液清除超氧陰離子自由基能力

3 結論

本試驗以白玉花生、黑花生2號和花育23各品種新鮮花生衣為原料，采用超聲波技術輔助、80%乙醇提取花生衣中的原花青素，用香草醛-鹽酸法及高效液相色譜（HPLC）法對原花青素單體組成含量及抗氧化活性（清除自由基能力）進行測定。結果表明，花育23（5）的原花青素含量最高，為0.234 g/g；3個品種花生衣原花青素組分中的單體種類及含量不同；清除DPPH自由基、羥自由基及超氧陰離子自由基能力最強的均是花育23（5）花生衣PC提取液，最弱的均是白花生3花生衣PC提取液。本研究可為將花生衣原花青素開發(fā)成天然抗氧化劑提供一定參考。