沈開強(qiáng)，韓曉彤，張鑾，李毅璞，丁延芹，杜秉海，汪城墻

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/山東省農(nóng)業(yè)微生物重點(diǎn)實驗室，山東 泰安 271018）

土壤中細(xì)菌的數(shù)量和種類繁多，是土壤生物類群的重要組成部分，參與土壤中幾乎所有的生化反應(yīng)，在有機(jī)物分解、生物地球化學(xué)循環(huán)等方面起重要作用，對土壤肥力和生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的形成有顯著影響［1-3］。細(xì)菌對環(huán)境變化較為敏感，所以常常將土壤細(xì)菌作為評價環(huán)境的重要指標(biāo)。

隨著山體海拔的升高，氣溫、降水、土壤等因素各不相同，勢必影響山體土壤細(xì)菌的群落組成和豐富度。近幾十年來，中外科學(xué)家對山體不同海拔的微生物分布差異做了大量研究工作。金裕華［4］發(fā)現(xiàn)，武夷山土壤真菌數(shù)量隨海拔升高而降低，土壤放線菌數(shù)量隨海拔升高而升高，土壤細(xì)菌和纖維素分解菌數(shù)量隨海拔升高而增加，固氮細(xì)菌和氨化細(xì)菌隨海拔的升高而降低。Bryant等［5］發(fā)現(xiàn)，落基山脈隨著海拔升高細(xì)菌類群豐富度、系統(tǒng)發(fā)育多樣性降低。張丹丹等［6］研究表明，革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽性細(xì)菌的多樣性與珠穆朗瑪峰海拔呈負(fù)相關(guān)。綜上所述，海拔因素極大程度地影響著山體土壤細(xì)菌的豐富度和多樣性。

泰山風(fēng)景秀麗，是中國五岳之首［7］，被譽(yù)為“天下第一山”［8］。泰山山脈東西綿延數(shù)百千米，主峰玉皇頂位于泰安城北，海拔1 545 m［9］。泰山是山東丘陵中最高大的山脈，地層結(jié)構(gòu)為蓋層風(fēng)化形成的泰山雜巖［10］，是我國最古老的地層之一。泰山氣候垂直變化明顯，年降水量隨高度增加而增加［11］，泰山多變的地理環(huán)境孕育了多種多樣的生物。隨著泰山旅游業(yè)的發(fā)展，當(dāng)?shù)氐淖匀画h(huán)境發(fā)生了改變，這在一定程度上改變了泰山土壤細(xì)菌的生存環(huán)境。人為因素對泰山環(huán)境的干擾問題有待探究和解決。

本試驗研究了泰山風(fēng)景區(qū)內(nèi)海拔260、850、1 500 m的土壤細(xì)菌多樣性、豐富度及群落結(jié)構(gòu)，分析了海拔因素對泰山土壤細(xì)菌群落的影響，可為研究泰山土壤細(xì)菌多樣性、分析泰山景區(qū)的環(huán)境擾動因素和探討生境保護(hù)等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 取樣

取樣地點(diǎn)位于山東省泰安市泰山風(fēng)景區(qū)內(nèi)，選取樣本共3組，分別位于海拔260 m紅門周邊（T260），海拔850 m中天門周邊（T850），海拔1 500 m玉皇頂周邊（T1500），每組3個生物學(xué)重復(fù)。土樣均為地表以下10 cm左右，且人為破壞較少處，取樣時間為2018年6月28日，取樣后立即于-20℃凍存，兩個月內(nèi)完成所有分析工作。

1.2 樣品處理

采用Illumina Miseq測序平臺，由上海派森諾生物科技股份有限公司對所取樣品進(jìn)行土壤細(xì)菌多樣性檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本測序數(shù)量

本次試驗選擇的測序數(shù)量為40 000條左右，使用QIIME軟件［12］對OTU［13］豐度矩陣中每個樣本的序列總數(shù)在不同深度下隨機(jī)抽樣，以每個深度下抽取到的序列數(shù)及其對應(yīng)的OTU數(shù)繪制稀疏曲線（圖1）。從圖中可以看出，曲線的斜率明顯變小，最后趨于平緩，說明各樣本檢測結(jié)果可信度高，可準(zhǔn)確反映真實的物種豐富度、多樣性和群落特征等指標(biāo)。

圖1 樣本的稀疏曲線圖

2.2 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性可用來表示每個樣本群落的細(xì)菌多樣性和豐富度。常用指數(shù)有Chao1指數(shù)［14］、ACE指 數(shù)［15］、Shannon指 數(shù)［16］和Simpson指數(shù)［17］。Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)側(cè)重于體現(xiàn)群落豐富度；Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)兼顧群落均勻度，均與群落多樣性呈正比。為了比較不同樣本的Alpha多樣性，首先對OTU豐度矩陣中的全體樣本統(tǒng)一進(jìn)行隨機(jī)重抽樣，從而校正測序深度引起的多樣性差異；隨后，使用QIIME軟件分別對每個樣本計算多樣性指數(shù)，分析結(jié)果見表1。T260的Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均最大，明顯高于T850和T1500，即樣本組T260的土壤細(xì)菌群落豐富度和多樣性最高。T850的Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)略高于T1500，Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)低于T1500，說明T850比T1500的土壤細(xì)菌群落多樣性略高，但細(xì)菌的豐富度較低。

表1 土壤樣本的細(xì)菌群落豐富度和多樣性指數(shù)

2.3 Beta多樣性分析

Beta多樣性可以考察不同樣本之間的群落結(jié)構(gòu)相似性與差異性。本研究通過主成分分析（principal component analysis，PCA）和非度量多維尺度分析（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）方法［18］，對樣本組的群落數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)進(jìn)行自然分解與排序，觀測樣本之間的差異。通過R軟件［19］對屬水平的群落組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行PCA分析，以二維圖像描述樣本間的自然分布特征，結(jié)果見圖2；對Unweighted和Weighted的UniFrac距離矩陣［20］分別進(jìn)行NMDS分析，結(jié)果見圖3。每個點(diǎn)代表一個樣本，兩點(diǎn)之間的距離越近，表明兩個樣本之間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似度越高。

T260有一個數(shù)據(jù)（T260.3）異常，分析時排除，其余結(jié)果生物學(xué)重復(fù)性較好。綜合分析，T1500和T850兩組數(shù)據(jù)的相似性較高，T260組數(shù)據(jù)與其他兩組數(shù)據(jù)的差異較大。由此判斷，海拔1 500 m和850 m處的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似度高，海拔260 m處與以上兩處的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似度低。

圖2 PCA分析的樣本二維排序圖

圖3 Unweighted UniFrac（A）和Weighted UniFrac（B）NMDS分析的樣本二維排序圖

2.4 樣本菌群組成分析

根據(jù)OTU測定結(jié)果，可以獲得樣本組在不同分類學(xué)水平上的群落組成情況，結(jié)果見圖4，門水平上的群落組成情況見圖5。由于T260.3在數(shù)據(jù)上與T260.1和T260.2差別很大，為排除偶然誤差影響，所有分析都將T260.3數(shù)據(jù)排除在外。

在各分類水平上，T260都表現(xiàn)出最多的群落數(shù)量，其次是T1500。T260在群落種類方面也表現(xiàn)出與T850和T1500的顯著差異。從門水平分析，T260、T850和T1500三組樣本中含量最多的均是放線菌門（Actinobacteria），所占比例分別為41.5%、48.4%和50.3%，隨著海拔增加所占比例逐漸增多。變形菌門（Proteobacteria）在T260中的含量最高，達(dá)到27.4%，在T850和T1500中分別為13.6%和14.8%。藍(lán)藻門（Cyanobacteria）在T260、T850和T1500樣本中也占有一定比例，分別為9.4%、8.1%和8.2%。軟壁菌門（Tenericutes）在三組樣本中差異顯著，T850和T1500中的含量分別為18.2%和16.7%，而T260中沒有檢測到該門類。T260中的異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）占12.0%，而T850和T1500中含量均低于0.2%。擬桿菌門（Bacteroidetes）含量差別也較大，在T260、T850、T1500中占比分別為1.7%、10.9%和9.3%。疣微菌門（Verrucomicrobia）在三組樣本中含量不高，具有隨著海拔增加逐漸減少的趨勢。纖細(xì)菌門（Gracilibacteria）在T260未檢測到，在T850和T1500中含量很少但比例相似。另外，厚壁菌門（Firmicutes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、匿桿菌門（Latescibacteria）、衣原體（Chlamydiae）等均只在T260樣本中檢測到?？傮w分析，T260中的細(xì)菌門水平上種類最為豐富，T850和T1500的門類比例相似性較大。

圖5 樣本組門水平上的群落組成和豐度分布

2.5 樣本間的OTU聚類分析

利用R軟件在97%的相似水平上對T260、T850和T1500的序列進(jìn)行OTU聚類分析，生成樣本組OTU的Venn圖（圖6）。樣本組T260、T850和T1500的平均OTU 數(shù)分別是1 958、1 023、1 173；T850的OTU數(shù)最少，相對于T260和T1500分別減少了47.8%和12.8%；T260比T1500的OTU數(shù)高66.9%。T260、T850和T1500共有的OTU數(shù)為184。T260、T850和T1500特有的OTU數(shù)分別為1 672、193和283。T260與T850共有的OTU數(shù)為205，與T1500共有的OTU數(shù)為265；T850和T1500共有的OTU數(shù)為809，明顯高于兩樣本組與T260的共有數(shù)量。從Venn圖分析可知，T850和T1500的群落相似性較高。

圖6 基于OTU的Venn圖

使用R軟件將3組樣本屬水平上的分類信息進(jìn)行聚類，繪制熱圖（圖7），熱圖用顏色變化表示數(shù)據(jù)多少，將高豐度和低豐度的物種進(jìn)行分類，紅色表示高豐度，綠色表示低豐度，直觀地反映了屬水平之間相似性和差異性。由圖7可以看出，T260相較于T850和T1500，Alicycliphilus、顫藍(lán)細(xì)菌屬（Oscillatoria）和IIumatobacter等的物種豐度較高。T850相較于T1500和T260，Pseudorhodoferax、無色桿菌屬（Achromobacter）和Salinirepens豐度較高。T1500相較于其余兩組，不動桿菌屬（Acinetobacter）和棲蘇打菌屬（Nitrincola）的豐度明顯較高。不同樣本組間的細(xì)菌屬水平存在明顯差異，T260與T850、T1500之間相似度較低，T850與T1500相似度較高。

2.6 菌群代謝功能預(yù)測

用菌群代謝功能預(yù)測工具PICRUSt［21］，通過將現(xiàn)有的16SrRNA基因測序數(shù)據(jù)與代謝功能已知的微生物參考基因組數(shù)據(jù)庫做比較，實現(xiàn)對細(xì)菌代謝功能的預(yù)測；預(yù)測過程還考慮了不同物種16SrRNA基因拷貝數(shù)的差異。總體而言，3組樣本預(yù)測出的菌群代謝功能相似，其中，膜轉(zhuǎn)運(yùn)、氨基酸代謝、碳代謝、復(fù)制修復(fù)和能量代謝的相關(guān)基因豐度較高。T260組菌株的能量代謝、細(xì)胞過程、遺傳過程和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因豐度較高，T850與T1500的復(fù)制修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、核酸代謝相關(guān)基因豐度較高。另外，3組樣本中都含有較豐富的外源物質(zhì)生物降解和代謝相關(guān)基因，可能與景區(qū)人員流動大，帶來的環(huán)境擾動有關(guān)。

圖7 結(jié)合聚類分析的屬水平群落組成熱圖

3 討論與結(jié)論

本試驗采集泰山不同海拔的土壤樣本，分析細(xì)菌群落之間的異同。低海拔樣本組T260相比于高海拔樣本組T850和T1500土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)都最高，群落結(jié)構(gòu)也最豐富，這可能與海拔260 m處的土壤細(xì)菌所處環(huán)境溫度較高有關(guān)；而高海拔組溫度較低、氧氣較為稀?。?2］，所以細(xì)菌多樣性較低。另外，樣本組T850的土壤細(xì)菌豐富度指數(shù)低于T1500，測得的細(xì)菌OTU數(shù)也較少，這可能與旅游業(yè)的發(fā)展造成中天門附近土壤細(xì)菌環(huán)境破壞嚴(yán)重有關(guān)。3組樣本中都含有較豐富的外源物質(zhì)生物降解和代謝相關(guān)基因，分析可能跟景區(qū)人員流動大，帶來的環(huán)境擾動相關(guān)。人為因素給泰山不同海拔土壤細(xì)菌多樣性和豐富度帶來了或多或少的影響，造成了部分細(xì)菌群落多樣性發(fā)生改變，因此環(huán)境修復(fù)問題應(yīng)受關(guān)注。