張文娟

(渭南職業(yè)技術學院，陜西 渭南 714026)

0 引言

獼猴桃又名奇異果，果肉中富含有糖、多種維生素和氨基酸、有機酸、K+、Mg2+以及相應的色素等等內容，新鮮的獼猴桃可以進行加工，將其加工成果品以及飲料罐頭，而且還可以做進一步的開發(fā)，同時獼猴桃的籽、葉子、枝條、花等部分都有進一步加工和開發(fā)的價值[1,2]。因此，獼猴桃有廣闊的市場發(fā)展前景和很好的研究價值。但是獼猴桃種植過程中會受病菌感染而出現病害，比如丁香假單胞菌，是導致獼猴桃病變的一種病原菌，可能導致獼猴桃出現一些大面積的病害，獼猴桃潰瘍病主要感染樹干、枝條、葉片及花，引起枝干潰病或者枝葉萎蔫[3,4]。獼猴桃潰瘍自1980年首次在日本報道以來，已在全球獼猴桃栽培區(qū)廣泛分布，當獼猴桃出現病害的時候，帶來的危害較大，會導致果實的產量以及質量出現大面積的下降，繼而給生產者帶來巨大的經濟損失[5,6]。分析導致獼猴桃出現病害的原因，其中一個因素就是大量使用農藥導致的抵抗力降低。大量的使用化學方面的農藥很容易會使病菌出現一定的耐藥性，藥物的效力逐漸下降；同時化學農藥的大量使用會出現較高的殘留，不僅可能污染環(huán)境，還可能影響人類的身體健康。因此，迫切需要創(chuàng)制高效、安全、低殘留的新型農藥，這對于獼猴桃以及相關疾病的抑制都是十分有效的，只有不斷地提升病害防治水平，才能保證獼猴桃的種植質量，進而提升獼猴桃生產水平[7,8]。筆者研究采集渭南市獼猴桃健康株，進行內生放線菌的分離純化，并對獼猴桃潰瘍病病菌進行拮抗試驗，篩選出拮抗菌株，從生物農藥角度為獼猴桃細菌性潰瘍病防治工作提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品 采集地點為陜西省渭南市臨渭區(qū)賀家村、高李村、華州區(qū)3個獼猴桃種植園區(qū)，于2018年4-5月份采集健康獼猴桃植株的枝條和葉片等組織，樣品共計29份。

1.1.2 病原菌 獼猴桃潰瘍病菌(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，Psa)由西北農林科技大學植物病理研究室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 淀粉酪素培養(yǎng)基：可溶性淀粉 10.0 g，K2HPO42.0 g，KNO32.0 g，NaCl 2.0 g，Casein 0.3 g，MgSO47H2O 0.05 g，CaCO30.02 g，FeSO47H2O 0.01 g，瓊脂粉 15.0 g，H2O 1 000 mL。

小米發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 10.0 g，小米 10.0 g， NaCl 2.5 g，蛋白胨3.0 g，CaCO31.0 g，(NH4)2SO41.0 g，H2O 1 000 mL，pH7.2。

高氏一號合成培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

1.1.4 主要試劑 HPD系列大孔樹脂、分析純甲醇、乙酸乙酯等(汕頭西隴化工廠)、氨芐青霉素(Ampicillin)為生化試劑。

1.2 方法

1.2.1 內生放線菌的分離、純化 用蒸餾水將樣品清洗干凈、自然晾干備用。使用打孔器切割葉片，使其成為直徑確定的小圓片。用無菌處理的枝剪將枝條剪成0.6 cm兩端均有切口的小段，按照組織塊表面消毒法，枝條：75%酒精沖洗3次→3.5%次氯酸鈉沖洗4次→75%酒精沖洗3次；葉片：75%酒精沖洗1次→3.5%次氯酸鈉沖洗2次→75%酒精沖洗1次，對組織表面進行消毒。消毒結束后即刻用無菌水清洗3次，末次清洗液取1 000 μL加入淀粉酪素培養(yǎng)基和高氏一號合成培養(yǎng)基制成的平板中，涂布均勻，置于28℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3 d，觀察表面是否有菌落長出，以檢測消毒是否徹底。

將表面消毒的組織塊無菌條件下貼在淀粉酪素培養(yǎng)基和高氏一號合成培養(yǎng)基制成的平板中，每皿貼4份，放置在28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，等待菌株長出菌落，然后采集菌落開展菌株的純化工作，最后將純化處理之后的菌株在培養(yǎng)基斜面上進行保存、備用。

1.2.2 內生放線菌的拮抗實驗 內生放線菌的液體發(fā)酵：在250 mL 三角瓶中裝入50 mL 小米培養(yǎng)基，滅菌，冷卻。接種各純化菌株到培養(yǎng)瓶中，置入28℃搖床，以180 r·min-1轉速培養(yǎng)5 d。過濾發(fā)酵液并收集濾液，4℃保藏備用。

活性測定：測定各菌株發(fā)酵液對獼猴桃潰瘍病的抑菌活性采用管碟法。將供試細菌獼猴桃潰瘍病菌制成濃度為1×106菌懸液，取1 mL菌懸液與9 mL的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基充分混勻，制成帶菌平板，各平板等距離放置牛津杯5個，各加發(fā)酵液 200 μL，37℃培養(yǎng) 24 h ，測量抑菌圈直徑，每處理重復3次。

1.2.3 WN34菌株發(fā)酵液活性粗提物制備 大孔吸附樹脂的選擇：取6份100 mL過濾好的菌株發(fā)酵液分別用預處理過的20 mL(濕體積)HPD100、HPD300、HPD400、HPD500、HPD600、HPD750大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附，重復三次。12 h后裝入層析柱，先用少量蒸餾水洗去雜質，然后分別用甲醇洗脫(解吸)。將甲醇洗脫液定容至一定體積，采用管碟法、濾紙片法對殘留液、甲醇洗脫液進行以獼猴桃潰瘍病病菌為指示菌的抑菌活性試驗。

針對這個問題，我們在課后進行了探討，最后得到一致結論，那就是我們在選取視頻的時候只注重了上課內容本身，沒有關注學生的興趣點，從而造成了課前師生互動的脫節(jié)，以至于整個教學系統(tǒng)在這個階段就已經崩塌了。

樹脂的動態(tài)飽和吸附量考察：取已處理好的HPD100樹脂20 mL(濕體積)裝柱，將準備好的菌株發(fā)酵液緩慢加入層析柱中，通過液用三角瓶收集并編號，每份100 mL，流速約為2 mL·min-1，采用管碟法對收集的各餾分進行以獼猴桃潰瘍病病菌為指示菌的抑菌活性試驗。

活性粗提物的制備：將90L發(fā)酵液經HPD100樹脂富集，用40%，60%，100%甲醇水梯度洗脫，100%甲醇餾分濃縮至一定體積即為活性粗提物。

1.2.4 WN34 菌株的大田實驗 田間病害防治實驗于 2018年 2 月下旬在渭南市臨渭區(qū)獼猴桃園進行，以全株噴霧和涂抹枝干的方法進行防效實驗，被試獼猴桃品種為徐香。①噴霧法: 分別用WN菌株發(fā)酵液粗提物稀釋液(濃度為原發(fā)酵液濃度)，進行全株噴施，每組處理發(fā)病株 10 株，間隔 7 d 噴藥 1 次，連續(xù)4 次。分別于7 d、14 d、21 d、28 d調查各個處理樹枝的病斑愈合情況，計算相對防效。以45%代森銨150倍稀釋液和清水為對照[9,10]。②涂抹法: 在施藥前，先用刀將植株發(fā)病部位的樹皮刮除，然后再涂抹WN菌株發(fā)酵液粗提物稀釋液(濃度為原發(fā)酵液濃度)，每組處理發(fā)病株10株，以45%代森銨150倍稀釋液和清水為對照。涂抹藥劑6個月后調查病斑愈合情況，以病斑處產生愈合組織為愈合病斑的依據，計算防治效果[11]。

病斑愈合率=(防治后病斑愈合數/防治前病斑總數)×100%

防治效果=[(處理區(qū)病斑愈合率-對照區(qū)病斑愈合率)/(1-對照區(qū)病斑愈合率)]×100%

2 結果與分析

2.1 內生放線菌的分離及拮抗實驗結果

實驗結果顯示，最后一次清洗液加入淀粉酪素培養(yǎng)基和高氏一號合成培養(yǎng)基制成的平板中，涂布均勻，置于28℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3 d，表面未觀察到菌落，說明表面消毒效果良好。從采集的獼猴桃植株的枝條和葉片等組織分離得到37株內生放線菌，其中從枝條組織中分離得到8株，葉片組織中分離得到29株。采用管碟法測定各菌株發(fā)酵液對Psa的抑菌活性，實驗結果見表1。

表1 初篩拮抗菌發(fā)酵液對獼猴桃潰瘍病菌的抑制活性

備注："+++"表示抑菌圈非常清晰，"++"表示抑菌圈比較清晰。

2.2 WN34菌株的大田實驗結果

采用噴霧法進行田間試驗的結果見表2。從表2可知，在噴藥14 d、21 d、28 d內，WN34菌株發(fā)酵液粗提物對獼猴桃潰瘍病都有較好的治療效果，防效優(yōu)于陽性對照45%代森銨，并且隨著時間的推移有一定程度的提高，在噴藥28 d后，WN34菌株發(fā)酵液粗提活性物對獼猴桃潰瘍病的防效提高至66.0%。采用涂抹法進行田間試驗的結果見表3。從表3可知，在涂抹藥劑后，WN34菌株發(fā)酵液粗提活性物對獼猴桃潰瘍病的防治效果為78.2%，優(yōu)于陽性對照45%代森銨。并且在實驗中觀察發(fā)現，涂抹藥劑6個月后病斑出現愈合現象，并且在病斑處后形成愈合層。說明WN34菌株發(fā)酵液對獼猴桃潰瘍病有較好的防治效果。

表3 菌株WN34發(fā)酵液活性粗提物涂抹法對獼猴桃潰瘍病的田間防治效果

3 結論

研究從采集的獼猴桃植株的枝條和葉片等組織分離得到37株內生放線菌，其中從枝條組織中分離得到8株，葉片組織中分離得到29株，其中8株內生放線菌的發(fā)酵液表現出對Psa有較強的抑制作用。說明葉片組織中內生放線菌多于枝條組織中的內生放線菌。采用管碟法測定WN34菌株發(fā)酵液對Psa的抑菌活性，抑菌圈直徑達到21 mm。

田間試驗結果表明：采用噴霧法，WN34菌株發(fā)酵液粗提活性物對獼猴桃潰瘍病有較好的治療效果，在噴藥28 d后，防效達到66.0%。采用涂抹法，WN34菌株發(fā)酵液粗提活性物防效為78.2%，優(yōu)于陽性對照45%代森銨。并且在實驗中觀察發(fā)現，涂抹藥劑6個月后病斑出現愈合現象，并且在病斑處后形成愈合層。說明WN34菌株發(fā)酵液對獼猴桃潰瘍病有較好的防治效果。

4 討論

內生菌具有一定的多樣性，植物的種類、生長年限以及培養(yǎng)過程等因素對其的成長都有一定影響。筆者在篩選獼猴桃內生放線菌時發(fā)現不同部位內生菌數量差異顯著，其中葉片中的內生放線菌多于枝干樣品。可能原因為葉片相對于枝干表面積大，與外界物質交換機會多，微生物更有可能進入植物組織。也有學者認為植物內生菌是通過植物體表面、根際的自然孔口或傷口等進入組織內部。筆者使用淀粉酪素和高氏一號兩種培養(yǎng)基來分離篩選獼猴桃組織中的內生放線菌，目的是盡量多的得到不同種類的內生放線菌，但即使使用不同種類的培養(yǎng)基，也不能確保將植物組織中所有的內生放線菌全部分離出來，并且有些內生菌不能在離體條件下生長，有些內生菌生長較慢，會被生長相對較快的菌株覆蓋，導致分離得到菌株有所遺漏。

筆者采用噴霧法和涂抹法兩種方法進行田間試驗，結果表明涂抹法防治效果(78.2%)優(yōu)于噴霧法(66.0%)?？赡苁且驗橥磕ǚㄔ趯嵤┻^程中是將病斑部位的組織刮除后再涂抹藥劑，縮短藥劑與病原菌接觸時間，快速抑制病情發(fā)展，避免外界氣候條件的影響，故優(yōu)于噴霧法。WN34菌株發(fā)酵液作為一種新型的抗獼猴桃潰瘍病生物防治藥劑開發(fā)，有很好的潛力。