李亞平，項(xiàng)福星，韓建國，方曉春，肖衛(wèi)華，韓魯佳

(1. 承德市農(nóng)林科學(xué)院，河北 承德 067000；2. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100083)

隨著煤炭、石油、天然氣等化石資源的日益枯竭，且在開發(fā)利用過程中造成大量溫室氣體排放和環(huán)境污染，木質(zhì)纖維作為自然界中儲(chǔ)量最豐富的可再生資源長期以來受到研究者廣泛關(guān)注[1]。作為木質(zhì)纖維之一的農(nóng)作物秸稈來源廣泛，是儲(chǔ)量豐富的可再生生物質(zhì)資源[2]。我國是農(nóng)業(yè)大國，每年各類生物質(zhì)秸稈產(chǎn)量巨大，其中，玉米秸稈的產(chǎn)量最大，約為2.2 億 t[3]，資源豐富。但利用率低，大量秸稈低效燃燒造成資源浪費(fèi)，且污染環(huán)境。因此，將玉米秸稈資源化開發(fā)利用具有很大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益，對(duì)“美麗鄉(xiāng)村”建設(shè)、節(jié)能減排、實(shí)現(xiàn)低碳經(jīng)濟(jì)轉(zhuǎn)型發(fā)揮著積極而重要的作用。

秸稈的資源化利用主要表現(xiàn)在利用纖維素酶等酶降解玉米秸稈轉(zhuǎn)化為還原糖，然后發(fā)酵生產(chǎn)燃料酒精、單細(xì)胞蛋白(SCP)及乳酸等有機(jī)酸物質(zhì)[4～6]。玉米秸稈主要由纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素組成，由于纖維素分子內(nèi)和分子間存在著大量的氫鍵，并在固態(tài)下聚集成不同水平的結(jié)晶性原纖結(jié)構(gòu)，以及木質(zhì)素、半纖維素對(duì)纖維素的保護(hù)作用，使得秸稈顯示出剛性和高度水不溶性，對(duì)試劑的可及度低，溶解困難，反應(yīng)均一性差[7～8]。因此，要對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理，提高酶解效率。

盡管已有學(xué)者對(duì)玉米秸稈酶解做了大量研究[4,6,9]，但對(duì)短時(shí)間超微粉碎預(yù)處理對(duì)酶解效果的影響研究甚少[10]。因此筆者擬采用短時(shí)間超微粉碎預(yù)處理手段對(duì)玉米秸稈進(jìn)行預(yù)處理，并對(duì)預(yù)處理后的玉米秸稈樣品進(jìn)行酶解試驗(yàn)研究。探究不同預(yù)處理時(shí)間對(duì)玉米秸稈粒徑分布和酶解后總還原糖及葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和纖維二糖等各種糖產(chǎn)量的影響，同時(shí)分析比較原樣和超微粉碎預(yù)處理樣品酶解的固體回收率、葡萄糖收率，研究超微粉碎預(yù)處理對(duì)玉米秸稈酶解效果的影響，以期對(duì)生物質(zhì)秸稈的資源化利用和工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

玉米秸稈，采自承德市農(nóng)林科學(xué)院“現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新基地”。取回后于通風(fēng)處自然晾干，粉碎至40目后封裝于密封袋中室溫避光保存?zhèn)溆谩?/p>

葡萄糖(≥99.5%)、阿拉伯糖(≥99%)、纖維素酶(Cellulast 1.5L)、纖維二糖酶(Novozyme 188)和pNPG來自 Sigma；木糖(≥99%)和纖維二糖(≥99%)來自Sigma-Aldrich；氫氧化鈉、3,5-二硝基水楊酸、苯酚、酒石酸鉀鈉和一水合檸檬酸等均為分析純，來自北京化工廠；偏重亞硫酸鈉，分析純，來自西隴化工股份有限公司；pNP，分析純，來自百靈威科技有限公司；四環(huán)素鹽酸鹽，分析純，來自北京藍(lán)弋化工產(chǎn)品有限責(zé)任公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

RT-34靜音研磨粉碎機(jī)：香港榮聰精密科技有限公司；CJM-SY-B高能納米球磨粉碎機(jī)：秦皇島市太極環(huán)納米制品有限公司；UV-2550紫外-可見分光光度計(jì)：SHIMADZU公司；Waters e2695高效液相色譜儀：Waters公司；Mastersizer 3000激光粒度儀：Malvern公司；XS205電子天平：METTLER TOLEDO公司；SevenEasy pH計(jì)：METTLER TOLEDO公司；Milli-Q超純水系統(tǒng)：MILLIPORE公司；SHA-B(A)水浴恒溫振蕩器：金壇市科析儀器有限公司；TW 20恒溫水浴鍋：優(yōu)萊博儀器有限公司。

1.3 玉米秸稈超微粉碎預(yù)處理

用高能納米球磨粉碎機(jī)對(duì)玉米秸稈 40 目粗粉樣品進(jìn)行超微粉碎，超微粉碎過程中不添加任何助磨劑、抗結(jié)塊劑，用循環(huán)冷卻水保持罐體溫度低于 30 ℃。選用強(qiáng)化不銹鋼磨罐，氧化鋯球作為磨介質(zhì)，球料體積比 2∶1，球磨介質(zhì)填充率為 35%，分別干法粉碎 0 h、0.5 h、1.0 h、1.5 h和2.0 h，將得到的樣品分別裝入密封袋內(nèi)室溫避光保存，分別命名為 BM0 h(即秸稈原樣)、BM0.5 h、BM1.0 h、BM1.5 h、BM2.0 h。

1.4 粒徑分布

筆者試驗(yàn)采用馬爾文公司的 MASTERSIZER 3000 激光衍射技術(shù)測(cè)量不同球磨時(shí)間的玉米秸稈的粒徑分布。系統(tǒng)由樣品分散裝置、光學(xué)平臺(tái)和軟件三部分構(gòu)成。樣品用 Aero S 干法附件分散，當(dāng)激光束穿過分散的顆粒時(shí)，通過測(cè)量散射光強(qiáng)來完成粒度測(cè)定[11]。測(cè)定時(shí)，取適量玉米秸稈粉體放于樣品分散裝置入口，空氣做為分散介質(zhì)進(jìn)行測(cè)量，測(cè)定粒徑范圍為0.01～3 000 μm。粒徑大小以中值粒徑表示，粒徑均勻度用粒徑跨度[12]表示。每個(gè)樣品測(cè)量 3 次。粒徑跨度如公式1所示。

粒徑跨度= (D90-D10)/D50

(1)

其中：D50、D10和D90分別代表粉體樣品累計(jì)分布百分?jǐn)?shù)分別達(dá)到 50%、10%、90%時(shí)所對(duì)應(yīng)的粒徑大小。

1.5 分析測(cè)定方法

纖維素酶濾紙酶活參照美國國家可再生能源實(shí)驗(yàn)室(National Renewable Energy Laboratory，NREL)的 NREL/TP-510-42628 標(biāo)準(zhǔn)方法[13]測(cè)定。纖維二糖酶活力采用 pNPG 法測(cè)定[14]。采用 Miller 的 3,5-二硝基水楊酸(DNS)法[15]測(cè)定酶解濾液中的總還原糖含量，每個(gè)樣品進(jìn)行 2 個(gè)重復(fù)測(cè)定。參考美國國家可再生能源實(shí)驗(yàn)室(NREL)的NREL/TP-510-42623 標(biāo)準(zhǔn)方法[16]，測(cè)定酶解濾液中葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和纖維二糖等各種糖的含量。

1.6 酶解方法

對(duì)玉米秸稈原樣、超微粉碎預(yù)處理后樣品分別進(jìn)行72 h酶解試驗(yàn)。稱取7 g樣品于500 mL的錐形瓶中，加入140 mL用 pH4.8 的檸檬酸鈉緩沖溶液稀釋的纖維素酶和纖維二糖酶混合液，使酶解過程中干物質(zhì)的含量達(dá)到 5%(w/v)，混合液中纖維素酶的加載量為 20 FPU·g-1干物質(zhì)，纖維二糖酶的加載量為 40 CBU·g-1干物質(zhì)，同時(shí)為避免酶解過程中微生物的干擾，在混合液中加入 0.08 g·L-1的四環(huán)素鹽酸鹽。充分混勻后，將所有的錐形瓶用保鮮膜密封好，放入水浴恒溫振蕩器中，在 50 ℃、150 rpm 的條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，72 h 后離心分離，取出上清液用于測(cè)定總還原糖含量和葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和纖維二糖等各種糖含量，固體部分用去離子水多次沖洗至中性后，真空冷凍干燥 24 h 后測(cè)定固體回收率。

1.7 固體回收率的測(cè)定

固體回收率通過公式(2)進(jìn)行計(jì)算：

固體回收率=(m1/m2)×100

(2)

式中，m1代表預(yù)處理后或酶解后玉米秸稈質(zhì)量，g；m2代表預(yù)處理前或酶解前玉米秸稈質(zhì)量，g。

1.8 葡萄糖收率

酶解后葡萄糖收率是指秸稈殘?jiān)附夂笏a(chǎn)生的葡萄糖量與用于預(yù)處理的秸稈中纖維素完全水解理論上應(yīng)該產(chǎn)生的葡萄糖的總量之比[17]。葡萄糖收率的計(jì)算如公式3所示。

葡萄糖收率(%)=ab/(c/0.9)×100

(3)

式中，a表示預(yù)處理后玉米秸稈的固體回收率；b表示秸稈酶解后葡萄糖產(chǎn)量，mg·g-1；c表示玉米秸稈原樣中的纖維素含量，此處c=30.50%；0.9 為葡萄糖與纖維素間的質(zhì)量轉(zhuǎn)化系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 粒徑分布

激光粒度法是目前測(cè)定粉體粒徑一個(gè)常用的方法，能直觀反映粉體的平均粒徑和粒度累計(jì)分布。不同超微粉碎時(shí)間后玉米秸稈粉體的的D10、D50、D90、粒徑跨度和平均粒徑分布曲線分別如表1和圖1所示。

表1 不同超微粉碎時(shí)間玉米秸稈粉體的D10、D50、D90和粒徑跨度

由表1可看出，在超微粉碎0～1.5 h期間，隨著粉碎時(shí)間的延長，中值粒徑減小，并在BM1.5 h時(shí)達(dá)到最小值8.23 μm，說明經(jīng)超微粉碎后，能有效減小其粉體平均粒徑，同時(shí)粉碎時(shí)間越長，其平均粒徑越小，在超微粉碎1.5 h時(shí)，玉米秸稈粒徑尺寸達(dá)到表觀粉碎極限。延長粉碎時(shí)間到2 h發(fā)現(xiàn)，D10、D50和D90相比BM1.5 h都有所增加。這可能是粉碎時(shí)間達(dá)2 h時(shí)，粉體中出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象，因分子間力大于破碎力，粉體中有小顆粒附著在大顆粒表面，形成部分大顆粒，導(dǎo)致平均粒徑增大[18～19]。粒徑跨度表示粒徑的均勻度、粒度分布范圍，粒徑跨度越小表示粒徑越均勻，粒度分布范圍越窄[12]。 由表1可看出，當(dāng)玉米秸稈經(jīng)超微粉碎后，粒徑跨度增大，說明超微粉碎后粒徑均勻度不如粗粉樣品。

由圖1可看出，相比于粗粉樣品，玉米秸稈超微粉碎后平均粒徑分布曲線整體左移，這是由于超微粉碎破壞了玉米秸稈的維管束[20]。由表1可知，超微粉碎后樣品的D50均小于30 μm，表明超微粉碎后顆粒向微細(xì)化發(fā)展，且已粉碎到細(xì)胞尺度[21]。

2.2 酶解糖產(chǎn)量

選擇玉米秸稈原樣、超微粉碎預(yù)處理后玉米秸稈(BM0.5 h、BM1.0 h、BM1.5 h、BM2.0 h)進(jìn)行酶解72 h試驗(yàn)。測(cè)定酶解72 h后總還原糖及葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和纖維二糖等各種糖產(chǎn)量如圖2所示?？傔€原糖產(chǎn)量指酶解后產(chǎn)生的包含本試驗(yàn)中葡萄糖等4種糖在內(nèi)的所有還原糖產(chǎn)量的總和。玉米秸稈原樣直接酶解后還原糖產(chǎn)量是155.05 mg·g-1，BM0.5 h、BM1.0 h、BM1.5 h、BM2.0 h酶解后還原糖產(chǎn)量分別為346.48 mg·g-1、466.80 mg·g-1、530.27 mg·g-1、613.60 mg·g-1，分別是原樣直接酶解的2.23倍、3.01倍、3.42倍、3.96倍。玉米秸稈原樣直接酶解后葡萄糖產(chǎn)量是90.43 mg·g-1，BM0.5 h、BM1.0 h、BM1.5 h、BM2.0 h酶解后葡萄糖產(chǎn)量分別為198.03 mg·g-1、267.39 mg·g-1、307.55 mg·g-1、351.47 mg·g-1，分別是原樣直接酶解的2.19倍、2.96倍、3.40倍、3.89倍。由圖可知，在0～2 h內(nèi)，預(yù)處理時(shí)間越長，酶解后總還原糖及葡萄糖等各種糖產(chǎn)量均越高。這是由于超微粉碎主要通過碰撞、擠壓和研磨等降低物料粒徑和增大比表面積和孔體積，使表面多糖物質(zhì)含量升高、木質(zhì)素和抽提物含量降低、增大纖維素表面積和木質(zhì)素表面積、降低結(jié)晶度，增加酶作用位點(diǎn)[22～24]，酶解效率相對(duì)于原樣提高很多，且在0～2 h內(nèi)，預(yù)處理時(shí)間越長，酶解效率越高。

2.3 酶解后固體回收率

玉米秸稈原樣和經(jīng)過預(yù)處理后樣品酶解72 h的固體回收率如圖3所示。由圖可知，固體回收率隨預(yù)處理時(shí)間延長而降低。原樣酶解后產(chǎn)糖量很低，固體回收率較高，為72.86%。超微粉碎預(yù)處理0.5 h、1 h、1.5 h、2 h后，酶解固體回收率分別為61.50%、49.46%、42.02%、37.46%，依次降低。預(yù)處理時(shí)間越長，酶解時(shí)產(chǎn)糖量越高，水解程度越高，所剩固體殘?jiān)缴?，固體回收率越低。與產(chǎn)糖量結(jié)果一致。

2.4 葡萄糖收率

葡萄糖收率可以反映酶解過程中秸稈中纖維素的降解程度，一定程度上反映了秸稈的酶解效率。葡萄糖收率越高，表示纖維素降解程度越高，酶解效率越高[17]。玉米秸稈原樣和預(yù)處理樣品酶解72 h的葡萄糖收率見表2。由表2可看出，原樣直接酶解后葡萄糖收率較低，為26.68%，超微粉碎預(yù)處理后酶解的葡萄糖收率升高，且預(yù)處理時(shí)間越長，葡萄糖收率越高。超微粉碎預(yù)處理2 h的葡萄糖收率高達(dá)98.57%，酶解效率相比原樣提高了2.69倍。由此可見，超微粉碎預(yù)處理對(duì)酶解具有重要的促進(jìn)作用。

表2 玉米秸稈原樣和預(yù)處理樣品酶解72 h的葡萄糖收率

3 結(jié) 論

(1)超微粉碎能有效減小玉米秸稈粉體平均粒徑，同時(shí)粉碎時(shí)間越長，其平均粒徑越小，在超微粉碎1.5 h時(shí)，玉米秸稈粒徑尺寸達(dá)到表觀粉碎極限。延長粉碎時(shí)間達(dá)2 h時(shí)，粉體中出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象，因分子間力大于破碎力，粉體中有小顆粒附著在大顆粒表面，形成部分大顆粒，導(dǎo)致平均粒徑增大。超微粉碎后樣品的D50均小于30 μm，表明超微粉碎后顆粒向微細(xì)化發(fā)展，且已粉碎到細(xì)胞尺度。

(2)在0～2 h內(nèi)，預(yù)處理時(shí)間越長，酶解后總還原糖及葡萄糖等各種糖產(chǎn)量均越高。BM2.0 h酶解還原糖和葡萄糖產(chǎn)量分別是玉米秸稈原樣直接酶解的3.96倍、3.89倍。超微粉碎預(yù)處理可以大幅度地提高秸稈酶解糖產(chǎn)量。

(3)玉米秸稈原樣酶解72 h的固體回收率較高，為72.86%。超微粉碎預(yù)處理時(shí)間越長，酶解時(shí)產(chǎn)糖量越高，水解程度越高，所剩固體殘?jiān)缴?，固體回收率越低。

(4)原樣直接酶解后葡萄糖收率較低，為26.68%。超微粉碎預(yù)處理后酶解的葡萄糖收率升高，且預(yù)處理時(shí)間越長，葡萄糖收率越高。超微粉碎預(yù)處理2 h的葡萄糖收率高達(dá)98.57%，酶解效率相比原樣提高了2.69倍。由此可見，短時(shí)間超微粉碎預(yù)處理可促進(jìn)秸稈降解為還原糖，提高酶解效率，對(duì)酶解具有重要的促進(jìn)作用。