丁芳芳，程茜菲

(陜西國際商貿(mào)學(xué)院，陜西省“綠色制造，協(xié)同創(chuàng)新”中心，陜西 西安 712046)

2007 年，Ohsawa等研究發(fā)現(xiàn)氫氣可選擇性地中和羥基自由基及過氧亞硝基陰離子，同時(shí)能清除過量的活性氧，進(jìn)而能有效緩解由腦缺血引起的氧化損傷。隨著科學(xué)的發(fā)展，目前氫氣被證明具有多種生物調(diào)節(jié)活性，如抗炎癥、抗氧化、抗凋亡等。有研究表明，富氫水對(duì)植物的生理功能具有一定的調(diào)節(jié)作用。富氫氣水對(duì)植物處理后，能增強(qiáng)植物對(duì)重金屬、鹽害、除草劑等危害的抗性，有研究表明，富氫水具有促進(jìn)當(dāng)歸生長發(fā)育的作用[1]，同時(shí)對(duì)綠豆、水稻、擬南芥等的種子萌發(fā)具有一定的促進(jìn)作用[2-3]。當(dāng)歸(Angelicasinensis(Oilv.)Diels)別名秦歸、云當(dāng)歸、岷當(dāng)歸，傘形科當(dāng)歸屬多年生草本植物，具有補(bǔ)血活血，調(diào)經(jīng)止痛，潤腸通便的功效。目前對(duì)于當(dāng)歸的研究主要集中在化學(xué)成分、藥理作用及質(zhì)量研究等方面，在當(dāng)歸的種植方面也較偏向于栽培條件、栽培管理等方面的研究[4～5]。而關(guān)于富氫水處理對(duì)當(dāng)歸種子萌發(fā)的影響少有報(bào)道，本研究擬研究不同濃度的富氫水溶液處理當(dāng)歸種子，研究富氫水處理對(duì)當(dāng)歸種子萌發(fā)的影響，以期最終能找到促進(jìn)當(dāng)歸種子萌發(fā)的有效方法。

1 材料與方法

1.1 材料

成熟的當(dāng)歸種子產(chǎn)于甘肅省岷縣，由陜西步長制藥集團(tuán)當(dāng)歸種植基地提供，選取當(dāng)年健康、籽粒飽滿、大小均一的當(dāng)歸種子，去翅后備用。

富氫水的制備：參照Nakao等[6]的實(shí)驗(yàn)方法，每2 L自來水水中插入1只金屬鎂型氫棒(由上海全人生物科技有限公司提供)，將容器密封，大約12 h后制得飽和氫水。然后將飽和氫水立即用自來水稀釋，制得不同濃度的富氫水溶液。

1.2 方法

1.2.1 種子預(yù)處理實(shí)驗(yàn) 當(dāng)歸種子先在室溫下用不同濃度的富氫水浸種一定時(shí)間，以促進(jìn)種子的萌發(fā)，然后用0.1% HgCl2處理6 min對(duì)種子表面進(jìn)行消毒[7]，在一定條件下進(jìn)行發(fā)芽實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 種子發(fā)芽實(shí)驗(yàn) 以在12 cm培養(yǎng)皿中鋪5 mm厚的濕沙(沙子選擇粒徑在100～200目之間的細(xì)沙，洗凈后160℃高溫消毒2h，使用時(shí)用無菌水?dāng)嚢璩蓾裆?，握之成團(tuán)，松之即散)作為發(fā)芽床[8]，將處理好的種子每50粒1組放在培養(yǎng)皿中進(jìn)行萌發(fā)(每組平行實(shí)驗(yàn)5組)，添加不同濃度的富氫水保持發(fā)芽床濕潤，將種子放在25℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用L16(43)正交表對(duì)浸種時(shí)富氫水濃度(W1)、浸種時(shí)間、發(fā)芽時(shí)富氫水濃度(W2)三個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，以發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)為指標(biāo)，正交因素水平表見表1。

表1 正交試驗(yàn)水平因素

1.2.4 觀測(cè)指標(biāo)及測(cè)定方法 種子置床24 h后開始觀測(cè)種子萌發(fā)情況，每24 h記錄一次，以胚芽突破種皮為標(biāo)準(zhǔn)，記錄正常發(fā)芽種子數(shù)，直至發(fā)芽結(jié)束。種子實(shí)驗(yàn)測(cè)定方法按照GB/T3543.4-1995《農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程 發(fā)芽實(shí)驗(yàn)》執(zhí)行[9-10]。

發(fā)芽率/%=終期(培養(yǎng)16 d)發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)×100；

發(fā)芽勢(shì)/%=規(guī)定時(shí)間內(nèi)(培養(yǎng)8 d后)發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù)×100；

發(fā)芽指數(shù)=(Gt/Dt)，其中，Gt為浸種后t天的凈發(fā)芽數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)；

活力指數(shù)=發(fā)芽指數(shù)×S，其中，S為相應(yīng)時(shí)期內(nèi)胚芽長度(其測(cè)定時(shí)將培養(yǎng)皿中發(fā)芽種子的胚根、幼芽從種子結(jié)合部切下后測(cè)定其長度，計(jì)算其平均值)。

α-淀粉酶活性采用比色法測(cè)定：以5 min內(nèi)每克樣品水解產(chǎn)生麥芽糖的毫克數(shù)表示酶活性大小，其計(jì)算公式如下：

α-淀粉酶活性(mg·g-1min-1)

式中：A：淀粉酶共同水解淀粉生成的麥芽糖量/mg；

A0：對(duì)照管中的麥芽糖量/mg；

VT：樣品稀釋總體積/mL；

W：樣品重量/g；

VU：比色時(shí)所用樣品的體積/mL；

2 結(jié)果與討論

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。由表2和表3可知，各因素對(duì)當(dāng)歸種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)的影響大小均為：浸種時(shí)間>浸種時(shí)富氫水濃度>發(fā)芽時(shí)富氫水濃度(B>A>C)，以發(fā)芽率為指標(biāo)的最佳處理方式為：A4B2(或B4)C2，顯著因素為B；以發(fā)芽勢(shì)為指標(biāo)的最佳處理方式為：A4B4C2，顯著因素為B；各因素對(duì)當(dāng)歸種子發(fā)芽指數(shù)的影響大小為：浸種時(shí)間>發(fā)芽時(shí)富氫水濃度>浸種時(shí)富氫水濃度(B>C>A)，以發(fā)芽指數(shù)為指標(biāo)的最佳處理方式為：A4B4C2。

在種子的萌發(fā)過程中無法進(jìn)行光合作用，種子需要的營養(yǎng)主要來自于其貯存的淀粉，通過淀粉酶將其轉(zhuǎn)化為糖分后吸收，故α-淀粉酶活性是衡量種子萌發(fā)一個(gè)重要的生理指標(biāo)。由表2、表3可知各因素對(duì)當(dāng)歸種子的α-淀粉酶活性的影響大小為：浸種時(shí)富氫水濃度>浸種時(shí)間>發(fā)芽時(shí)富氫水濃度(A>B>C)，以α-淀粉酶活性為指標(biāo)時(shí)的最佳處理方式為：A4B4C2，顯著因素為A、B，即：浸種時(shí)富氫水濃度及浸種時(shí)間，且富氫水處理后α-淀粉酶活性均有所提高，故推測(cè)富氫水可以通過提高α-淀粉酶活性來促進(jìn)種子的萌發(fā)。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

綜合考慮，確定最優(yōu)的處理方式為A4B4C2，即：浸種時(shí)富氫水濃度為50%，浸種時(shí)長為24h，發(fā)芽時(shí)使用的富氫水濃度為10%。在最優(yōu)處理?xiàng)l件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，發(fā)芽率為90%，發(fā)芽勢(shì)為72，發(fā)芽指數(shù)為6.35，α-淀粉酶活性為6.51。

眾所周知，低溫與干燥是保持當(dāng)歸種子發(fā)芽的重要因素，為使當(dāng)歸種子發(fā)芽快、出苗齊，萌發(fā)前需要進(jìn)行浸種處理，研究結(jié)果表明，在考察的三種因素中，浸種時(shí)間長短是影響種子發(fā)芽的顯著性因素，最合適的浸種時(shí)間為24 h，在此時(shí)當(dāng)歸種子的含水量更適合當(dāng)歸種子的萌發(fā)。

有研究表明[11]，植物在生長過程中能自主產(chǎn)生氫氣，并且當(dāng)植物生長的外部環(huán)境較差時(shí)，內(nèi)源性氫且釋放量會(huì)有所增加，而外源補(bǔ)給氫氣也提高了內(nèi)源氫氣的釋放量，所以，諸多研究發(fā)現(xiàn)，氫氣在動(dòng)植物和人類在抗逆境環(huán)境及疾病治療中都起到了重要作用。在本實(shí)驗(yàn)過程中，富氫水處理后當(dāng)歸種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)均有所增加，說明富氫水具有促進(jìn)當(dāng)歸種子發(fā)芽的作用。

3 結(jié)論

浸種時(shí)富氫水濃度為50%，浸種時(shí)長為24h，能更好地解除種子休眠，發(fā)芽時(shí)使用的富氫水濃度為10%，此時(shí)當(dāng)歸種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)及α-淀粉酶活性均較高，說明此條件下的當(dāng)歸種子的萌發(fā)力較優(yōu)。在考察的三種因素中，浸種時(shí)間長短是影響種子發(fā)芽的顯著性因素，最合適的浸種時(shí)間為24h。經(jīng)過富氫水處理后當(dāng)歸種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)均有所增加，說明富氫水具有促進(jìn)當(dāng)歸種子發(fā)芽的作用。