成思瓊，顏 盟，梁 彬，韓秀清

(1.楊凌新世界組培有限公司,陜西 楊凌 712100；2.陜西省果業(yè)研究發(fā)展中心,陜西 楊凌 712100；3.陜西新世界果業(yè)集團(tuán)有限公司,陜西 楊凌 712100)

目前，世界現(xiàn)代蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的趨勢(shì)是無毒、矮化、自根[1]。使用矮化砧木是實(shí)現(xiàn)蘋果矮化密植栽培效果最為顯著、應(yīng)用最廣泛的一種途徑[2]。近年來，蘋果矮化自根砧因其樹體矮小，適于密植，且具有早果、豐產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、果品均一性好等優(yōu)點(diǎn)，在世界各國得到廣泛的應(yīng)用[3]。砧木M9與M26作為應(yīng)用較廣的蘋果主要矮化砧木，其在生產(chǎn)上需求量較大。但是，蘋果砧木M9和M26的繁殖，還存在繁殖系數(shù)低、扦插生根難、試管苗成活率低且難于生根等問題[4]，嚴(yán)重的影響了蘋果良種化和產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。而組織培養(yǎng)技術(shù)為蘋果砧木快繁開辟了新的途徑。我國的植物組織培養(yǎng)水平居世界領(lǐng)先地位[5-7]，已有大量的蘋果砧木及新品種通過組織培養(yǎng)途徑建立了快繁體系[8-10]。王淼淼[11]等研究發(fā)現(xiàn)蘋果矮化砧木“矮砧6號(hào)”適宜增殖培養(yǎng)的植物生長調(diào)節(jié)劑配比為6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.05-0.1 mg·L-1，增殖系數(shù)可達(dá)到每4周4.53倍；適宜組培苗生根的植物生長調(diào)節(jié)劑為IAA 1.0 mg·L-1+IBA 0.4 mg·L-1，平均生根率為90%以上，平均生根數(shù)為6條，根系發(fā)達(dá)，移栽后成活率達(dá)90%以上；孫清榮等[12]以蘋果抗寒半矮化砧木“54-118”為試材，研究發(fā)現(xiàn)，無菌苗的適宜增殖培養(yǎng)基為QL+6-BA 1 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1+30 g·L-1蔗糖，增殖系數(shù)為5.1，適宜的生根培養(yǎng)基為1/4MS+ IBA 0.5 mg·L-1+20 g·L-1蔗糖，生根率為77.9%，平均每株根數(shù)為3.5；楊艷敏等[13]研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于品種“馬克9”，最佳誘導(dǎo)、增殖和生根培養(yǎng)基分別為MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1、6-BA 0.8 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1和1/2MS+IBA 0.5 mg·L-1+NAA 0.3 mg·L-1，誘導(dǎo)率為85.7%；對(duì)于品種“遼砧2號(hào)”，最佳誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基分別為MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1、6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1誘導(dǎo)率為87.5%，最佳生根培養(yǎng)基同“馬克9”；對(duì)于品種“GM265”，最佳誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基分別為MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1、6-BA 0.8 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1，誘導(dǎo)率為78.5%，最佳生根培養(yǎng)基同“馬克9”。筆者試驗(yàn)研究蘋果砧木M9與M26的離體培養(yǎng)，總結(jié)系統(tǒng)的組培快繁體系，以期為工廠化育苗提供可靠的技術(shù)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

蘋果砧木M9-T337、M26，均由楊凌新世界組培有限公司種質(zhì)資源圃提供。選擇生長健壯且無病蟲害的一年生枝條為試材，使用時(shí)只選取幼嫩新梢的莖尖2～3 cm。

1.2 方法

試驗(yàn)在楊凌新世界組培有限公司組培實(shí)驗(yàn)室及馴化溫室內(nèi)進(jìn)行?；A(chǔ)培養(yǎng)基為MS和WPM，生長調(diào)節(jié)劑主要有BA、IBA、IAA、NAA、GA等，培養(yǎng)基滅菌條件為122℃、20 min，培養(yǎng)室內(nèi)溫度均為24±2℃，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，光照時(shí)間16 h·d-1。

1.2.1 外植體消毒方法 4～5月份從種質(zhì)資源圃選取兩個(gè)砧木的新稍或帶腋芽的莖段，去掉大葉，剪成2～3 cm長,置于培養(yǎng)瓶中。在超凈工作臺(tái)上，先用75%的酒精處理30 s，再用1%的次氯酸鈉處理10、12、15 min或0.1%升汞處理5、8、10 min，用無菌水沖洗4-5次，然后用無菌濾紙吸干表面水分，用手術(shù)刀切掉變褐損傷部分，莖段長度大致為1～2 cm，每個(gè)莖段帶1～2個(gè)腋芽，接種于初代培養(yǎng)基中(MS+6-BA1.0 mg·L-1+IBA0.5 mg·L-1+蔗糖30 mg·L-1+瓊脂6.5 mg·L-1，PH5.8)，每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，重復(fù)3次，置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，接種25 d后統(tǒng)計(jì)污染率、褐化率及成活率。

污染率(%)=污染數(shù)/接種數(shù)×100%；

褐化率(%)=褐化數(shù)/接種數(shù)×100%；

成活率(%)=成活數(shù)/接種數(shù)×100%。

1.2.2 初代培養(yǎng)基的篩選 初代基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS+蔗糖30 mg·L-1+瓊脂6.5 mg·L-1，pH5.8，另附加激素6-BA(0.5，1.0，1.5 mg·L-1)+NAA(0.01，0.025，0.05 mg·L-1)，以及6-BA(0.5，1.0，1.5 mg·L-1)+IBA(0.3，0.4，0.5 mg·L-1)，在上述添加不同激素配比的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行外植體建立，每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，重復(fù)3次。

1.2.3 繼代培養(yǎng)基的篩選 經(jīng)過初代培養(yǎng)獲得的外植體，即可接種在繼代培養(yǎng)基上進(jìn)行增殖培養(yǎng)，繼代基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS+蔗糖40 mg·L-1+瓊脂6.5 mg·L-1，PH5.8，另附加激素6-BA(0.3，0.5，0.75 mg·L-1)+NAA(0.05，0.1，0.15 mg·L-1)，以及6-BA(0.3，0.5，0.75 mg·L-1)+IBA(0.3，0.4，0.5 mg·L-1)，在上述添加不同激素配比的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，重復(fù)3次，25d后調(diào)查芽的生長狀況，統(tǒng)計(jì)增殖率。

增殖率(%)=增殖莖尖數(shù)/接種莖尖數(shù)×100 %。

1.2.4 生根培養(yǎng)基的篩選 選生長健壯、長勢(shì)一致、高度1.5 cm左右的繼代苗，接種到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，新梢接種后置于黑暗下培養(yǎng)5 d，此后正常光下培養(yǎng)[3]。生根培養(yǎng)基為1/2MS(WPM)+蔗糖25 mg·L-1+瓊脂6.5 mg·L-1，PH5.8，另附加激素IBA(0.3，0.5，0.75 mg·L-1)+IAA(0.3，0.5，0.75 mg·L-1)，在上述添加不同激素配比的培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，每個(gè)處理接種30個(gè)繼代苗，重復(fù)3次，接種20 d后統(tǒng)計(jì)生根率、生根數(shù)和生根長度。

生根率(%)=長出根的試管苗數(shù)/接入的試管苗數(shù)×100%；

平均根條數(shù)(條/株)=長出根的總條數(shù)(條)/接入的試管苗數(shù)(株)。

1.2.5 馴化煉苗 馴化煉苗分為閉瓶煉苗和開口煉苗兩個(gè)階段。

閉瓶煉苗：把生根15 d左右的試管苗搬入溫室進(jìn)行馴化，控制溫度在22～25℃，光強(qiáng)在4 000～8 000 lx，閉瓶煉苗10～15 d后，先松蓋通氣后揭蓋，逐步適應(yīng)外界環(huán)境，一般換氣時(shí)間為3～5 d。

開口煉苗：揭蓋后繼續(xù)煉苗3～7 d，期間根據(jù)天氣情況噴0.1%的CaCl2溶液，使葉片適應(yīng)低濕環(huán)境。前期需要遮陽，將光照控制在4 000～8 000 lx，試管苗莖干微呈紅色，葉大而濃綠，根系木質(zhì)化時(shí)開始移栽。

1.2.6 移栽及栽后管理 從瓶內(nèi)取出經(jīng)過鍛煉的生根試管苗，除去根部的培養(yǎng)基，移栽到營養(yǎng)缽中，置于溫度25℃左右，光照6 000～8 000 lx的溫室或塑料大棚中。移栽基質(zhì)選用下層2/3基質(zhì)，上層1/3蛭石，移栽后立即用0.1%多菌靈溶液澆透，以殺菌保濕，最后搭小拱棚覆蓋，遮蔭。以后每3 d噴1次多菌靈溶液，移栽后1周左右通風(fēng)，增強(qiáng)光照，控制溫度不宜過高過低，有助于促進(jìn)試管苗緩苗，早進(jìn)入速生期，減少病害，提高成活率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行處理，使用SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，處理之間的比較采用單因素方差分析(Duncan，P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方法對(duì)外植體誘導(dǎo)分化的影響

從表1可知，隨著消毒劑處理時(shí)間的延長，M26和M9-T337污染率呈下降趨勢(shì)，褐化率呈升高趨勢(shì)；同一品種，0.1%HgCl2處理效果明顯優(yōu)于5% NaClO，但是處理時(shí)間越長，褐化率越高。5% NaClO處理時(shí)，誘導(dǎo)率在處理15 min時(shí)最高，分別為19.8%和18%；0.1% HgCl2處理時(shí)，誘導(dǎo)率在處理8 min時(shí)最高，分別為28.5%和31.2%，由此可見，升汞處理時(shí)間不宜太長，處理后對(duì)外植體的毒害比較大。綜合比較，M26和M9-T337最佳的外植體消毒方法為0.1% HgCl2處理8 min。

2.2 不同激素及濃度配比對(duì)初代培養(yǎng)效果的影響

由表2可知，適宜濃度的6-BA和NAA及IBA激素配比可以誘導(dǎo)M26和M9-T337外植體的再生，但不同的激素組合對(duì)外植體的誘導(dǎo)率不同。隨著6-BA濃度的提高，誘導(dǎo)率呈升高趨勢(shì)，在1.0 mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)率最高。此后隨著6-BA濃度的升高，誘導(dǎo)率逐漸下降。不同的激素組合，對(duì)外植體的誘導(dǎo)效果也不相同，6-BA濃度適宜的條件下，一定濃度范圍內(nèi)，外植體的誘導(dǎo)率隨NAA和IBA濃度的增加而增加。M26最適宜的外植體建立激素組合為6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.025 mg·L-1，芽誘導(dǎo)率最高為44.9%；M9-T337最適宜的激素組合為6-BA1.0 mg·L-1+IBA0.5 mg·L-1，芽誘導(dǎo)率最高為35.8%。

2.3 不同激素及濃度配比對(duì)繼代培養(yǎng)效果的影響

由表3可知，不同濃度的 6-BA 處理對(duì)蘋果品種和砧木繼代培養(yǎng)的分化有顯著差異，6-BA 濃度在0.3～0.75 mg·L-1的濃度范圍內(nèi)，分化系數(shù)隨濃度增加而先升高后降低。當(dāng) 6-BA的處理濃度為0.5 mg·L-1時(shí)，兩個(gè)品種繼代培養(yǎng)的分化系數(shù)均顯著高于其它濃度處理。繼代苗的高度受NAA和IBA濃度的影響比較大，由表3可知，IBA濃度0.5 mg·L-1時(shí)，M26和M9-T337繼代苗最高，分別為1.79 cm和1.81 cm。M26最佳的繼代培養(yǎng)激素配比為6-BA0.5 mg·L-1+NAA0.05 mg·L-1，M9-T337最佳的繼代培養(yǎng)激素配比為6-BA0.5 mg·L-1+IBA0.5 mg·L-1。

表1 不同消毒方法對(duì)外植體誘導(dǎo)分化的影響

表2 不同激素及濃度配比對(duì)芽誘導(dǎo)分化的影響

表3 不同激素及濃度配比對(duì)繼代培養(yǎng)的影響

表4 不同激素及濃度配比對(duì)生根培養(yǎng)的影響

2.4 不同激素及濃度配比對(duì)生根培養(yǎng)效果的影響

由表4可知，不同的培養(yǎng)基種類，對(duì)蘋果砧木M26和M9-T337生根效果的影響不同，當(dāng)激素種類及濃度相同時(shí)，1/2WPM培養(yǎng)基生根效果優(yōu)于1/2MS培養(yǎng)基的升高效果，生根率高，單株生根條數(shù)多，且愈傷組織比較小。適宜濃度的生長素可以促進(jìn)根的生長。當(dāng)IAA濃度為0.5 mg·L-1時(shí)，生根率和單株生根數(shù)隨著IBA濃度的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)；當(dāng)IBA濃度為0.5 mg·L-1時(shí)，生根率和單株生根數(shù)隨著IAA濃度的增加也呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。由此可知高濃度的生長素會(huì)抑制根的生長。M26和M9-T337最適宜的生根培養(yǎng)基均為1/2WPM+IAA 0.5 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1。

3 結(jié)論與討論

蘋果砧木能夠成功離體培養(yǎng)的關(guān)鍵在于建立外植體[14]。外植體的建立過程中，材料是否污染、取材時(shí)間、消毒方法及時(shí)間等因素都直接或間接的影響外植體建立[15]。筆者研究以M26和M9-T337的離體新稍進(jìn)行初代培養(yǎng)，研究發(fā)現(xiàn)最佳的消毒方法為0.1% HgCl2處理8 min，最佳的初代培養(yǎng)基分別為MS+6-BA1.0 mg·L-1+NAA0.025 mg·L-1和MS+6-BA1.0 mg·L-1+IBA0.5 mg·L-1。

在蘋果砧木M26與M9-T337試管苗增殖培養(yǎng)過程中，植物激素的種類和濃度是影響繼代擴(kuò)繁成功的關(guān)鍵，細(xì)胞分裂素的濃度尤為重要[16]。生長素與細(xì)胞分裂素對(duì)細(xì)胞生長分化具有協(xié)同作用，它們不同配比與不同量，對(duì)細(xì)胞分化起到至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用[2]。此外，培養(yǎng)基種類與基因型也是繼代培養(yǎng)能否成功兩個(gè)非常重要的因素[17]。試驗(yàn)得出M9與M26的最佳增殖培養(yǎng)基配方分別為MS+6-BA0.5 mg·L-1+NAA0.05 mg·L-1和MS+6-BA0.5 mg·L-1+IBA0.5 mg·L-1。

組培苗的生根需要一定時(shí)間暗培養(yǎng)來促進(jìn)根原基的形成，孫清榮等[18]研究認(rèn)為，暗培養(yǎng)5 d再轉(zhuǎn)光下培養(yǎng)為誘導(dǎo)蘋果矮化砧GM256試管苗生根的最佳培養(yǎng)條件。本研究在生根培養(yǎng)的過程中，新稍接種后置于黑暗下培養(yǎng)5 d，此后正常光下培養(yǎng)，生根效果好。培養(yǎng)基種類對(duì)組培苗的生根影響也很大，徐凌飛等[19]研究MS、1/2MS、1/3MS和1/4MS四種培養(yǎng)基對(duì)碭山酥梨試管苗生根的效應(yīng)，得出1/4MS為其最適生根培養(yǎng)基。張慶田[14]研究發(fā)現(xiàn)基本培養(yǎng)基1/2WPM確實(shí)比1/2MS適合于蘋果砧木M9的生根，在試管苗整個(gè)生根過程中，生長調(diào)節(jié)劑必不可少。三種生長素類物質(zhì)的活性強(qiáng)弱順序?yàn)镹AA>IBA>IAA。周莉[20]研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的NAA較IBA和IAA更利于蘋果砧木的生根。本研究發(fā)現(xiàn)，M26和M9-T337最適宜的生根培養(yǎng)基均為1/2WPM+IAA 0.5 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1。