王 瀟, 韓秀清, 成思瓊, 郝興安

(1.西北農(nóng)林科技大學，陜西 楊凌 712100；2. 陜西新世界果業(yè)集團有限公司，陜西 楊凌 712100)

蘋果莖溝病毒是一種寄主范圍廣泛的潛隱性病毒，一般不表現(xiàn)出明顯的外部癥狀，但影響嫁接親和性，以及蘋果樹的發(fā)育和產(chǎn)量[1]。蘋果樹被ASGV侵染后產(chǎn)量可減少30%，而且果面光滑度降低，造成果實產(chǎn)量和品質(zhì)下降，甚至引起果樹死亡。一旦被侵染，果樹將終生代毒，會給果品生產(chǎn)帶來持續(xù)性的危害。除了危害蘋果樹外，該病毒還侵染梨、柑橘、櫻桃、杏等果樹和百合[2-4]。

ASGV是我國蘋果和梨樹上發(fā)生普遍的潛隱病之一，分布于各主要蘋果和梨產(chǎn)區(qū)。劉福昌等(1989)報道我國的渤海灣果區(qū)、黃河故道果區(qū)和西北高原果區(qū)栽蘋果品種和營養(yǎng)系矮生砧木潛帶ASGV的帶毒株率為33.4%～100%[5]。

ASGV是發(fā)形病毒屬(Capillovirus)的代表種。ASGV粒子為彎曲線狀，長600-700 nm，直徑12 nm，螺旋對稱結(jié)構(gòu)[6, 7]。

蘋果莖溝病毒基因組為6 496 nt的正義單鏈RNA, 其3' 端有一個Poly(A),上游是一個142 nt的非翻譯區(qū)?；蚪MRNA 含有2 個開放閱讀框(ORF), 其中ORF1編碼產(chǎn)生一個241 kD的多聚蛋白, 隨后切割成一些功能產(chǎn)物, 包括甲基轉(zhuǎn)移酶(Mt)、類木瓜蛋白酶(PPro)、解旋酶(Hel)和聚合酶( Pol),外殼蛋白(Coat Protein, CP)在C端；ORF2位于ORF1 之內(nèi),靠近3'端,編碼一個36 kD的運動蛋白(Movement Protein, MP)[8, 9]。ASGV病毒MP基因與CP基因相對保守,且CP基因的保守性更強[9-11]。2000 年ICTV第7次病毒分類報告,將CP和MP基因氨基酸序列差異的大小作為發(fā)形病毒屬(Capillovirus)分種的重要依據(jù)之一[7, 9]。GenBank數(shù)據(jù)庫中8個ASGV分離物CP基因核苷酸序列同源性為89.5%～99.7%, 氨基酸序列同源性為93.2%～100%[7]。

蘋果莖溝病毒病屬于難治療病害。至今尚無有效的防治藥物，必須清除病株才能控制病害的蔓延。目前較為可行的控制措施是實行苗木脫毒及無毒栽培，控制其擴展。建立高效靈敏的檢測技術(shù)，成為解決種苗檢疫、抗病性早期鑒定等基本問題的前提，也是果樹無毒化栽培的基本保障[1, 12]。

本研究以中國蘋果上分離獲得的ASGV毒原為材料，克隆了ASGV cp基因，分析比較了基因序列及其系統(tǒng)進化，預(yù)測并分析了蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，并在原核系統(tǒng)中進行了表達分析。這為ASGV病毒抗體制備，以及基于血清學的ASGV檢測方法的建立提供了重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

ASGV毒源采自陜西楊凌新世界組培公司苗圃基地。限制性內(nèi)切酶、克隆載體pMD? 18-T Simple Vector購自TARAKA公司, M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，Taq酶, T4 DNA 連接酶及DNA 分子量標準購自FERMENTAS ( MBI )公司, Biozol-Reagent試劑購自Invitrogen公司,溴化乙錠，IPTG等購自Sigma公司。pET30a(+)表達載體，JM109，BL21(DE3) plyss感受態(tài)細胞等本實驗室保存。引物合成和核酸序列測定由楊凌奧科公司進行。

1. 2 方法

1.2.1 RNA提取 從陜西楊凌新世界組培公司苗圃基地采集疑似果樹枝條和葉片，使用Biozol-Reagent提取植物總RNA。

1.2.2 RT-PCR擴增及產(chǎn)物的克隆 根據(jù)已報道的CMV CP基因序列(GenBank登錄號D14995.2)，設(shè)計并合成克隆引物ASGV-CP1/2 (ASGV-CP1：ATGAGTTTGGAAGACGTGC，ASGV-CP2： CTAACCCTCCAGTTCCAGA )。依據(jù)基因克隆測序結(jié)果設(shè)計并合成表達引物ASGV-CP3/4 (ASGV-CP3:CGCGGATCCAGTTTGGAAGACGTGC，ASGV-CP4: CCGGAATTCCTAACCCTCCAGTTCCA)。其中ASGV-CP3/4在5'端和3'端分別引入了BamH I和EcoR I酶切位點(見下劃線)。以植物總RNA為模板，以O(shè)ligod(T)18 Primer為引物進行反轉(zhuǎn)錄，再以ASGV-CP1/2為引物對進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物克隆后測序。

1.2.3 重組表達載體構(gòu)建 以陽性克隆質(zhì)粒為模板，以ASGV-CP3/4為引物對，PCR克隆引入酶切位點。PCR產(chǎn)物純化后T-A連接到克隆載體。測序驗證后，BamH I/EcoR I雙酶切后連接到pET30a(+)表達載體，熱激轉(zhuǎn)化BL21(DE3)plyss感受態(tài)細胞。

1.2.4 原核表達分析 測序驗證的陽性克隆菌液，過夜活化后按1︰100(v/v)加入到LB培養(yǎng)基中，當菌液OD260達到0.2-1.0時，加入IPTG誘導表達3 hr。煮沸法提取總蛋白，12% SDS-PAGE電泳檢測。

1.2.5 ASGV cp基因的分子生物學分析 采用

Vector NTI(10.0)進行ASGV CP基因核苷酸序列分析。采用DNAMAN軟件進行ASGV cp基因核苷酸多序列比對分析。采用MEGA4.0軟件[13]進行ASGV cp基因進化樹構(gòu)建。采用GenBank，SWISS-MODEL和NPS@等數(shù)據(jù)庫中的在線軟件對推譯的ASGV-CP基因編碼的氨基酸序列進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析及預(yù)測。

2 結(jié)果

2.1 基因克隆與序列分析

以蘋果葉片總RNA為模板，ASGV-CP1/2為引物做RT-PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢查得到一條分子量約為700bp的特異性條帶。將擴增獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后T-A連接，重組克隆經(jīng)雙向測序，拼接獲得ASGV CP基因全長序列。采用GenBank數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov)在線軟件BLAST比對分析后確定為ASGV CP基因序列。ASGV CP開放閱讀框全長714個核苷酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAG。理論上表達翻譯處一個由237個氨基酸殘基組成的27 kD蛋白。該基因產(chǎn)物和預(yù)期的ASGV外殼蛋白相符合[14, 15]。將該序列登錄到GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為EU236258。

2.2 序列比對與基因克隆

將該基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov)應(yīng)用在線軟件BLAST比對分析后，獲得已報道的ASGV 7個分離物核苷酸全序列，分別是：分離于日本蘋果的P-209(D14995.2)[16]，分離于日本百合的L(D16681)[15]，分離于日本百合的Li- 23(AB004063)[17]，分離于中國臺灣金錢橘的Kumquat 1(AY646511)，分離于中國臺灣臍橙的LCd-NA-1(FJ355920)，分離于韓國的梨樹的ASGV- K(AY596172)和分離于美國野檸檬的CTLV-ML(EU553489)。采用DNAMAN軟件，將ASGV CP基因的核酸序列和推導的氨基酸序列與以上7個分離物的cp基因比較，結(jié)果如表1。

表1 ASGV cp基因序列比對

注：斜線上為氨基酸同源率，斜線下為核苷酸同源率。

筆者試驗分離得到的ASGV cp基因與其他分離物cp基因核酸同源率為88.80%～91.90%，氨基酸同源率為93.70%～96.60%。其中本試驗分離得到的ASGV CP基因和分離自日本百合的L(D16681)，Li- 23(AB004063)同源率最高，核苷酸同源率達到了91.90%。來自于不同地區(qū)，不同氣溫帶和不同寄主的ASGV分離物CP基因表現(xiàn)出了很高的同源性，反應(yīng)出ASGV cp基因在ASGV病毒的進化和分化中是一個相對保守的基因。

以ASGV cp基因為模板，進一步構(gòu)建了ASGV的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有的8個分離物分化為3個分支。來自日本百合的兩個分離物L(D16681)和Li- 23(AB004063)聚合成一個小分支后，與分離自韓國的梨樹的ASGV- K(AY596172)共同組成了一個大的分支。本試驗中的ASGV cp與來自日本蘋果的的P-209(D14995.2)組成另一個大的分支。分離于中國臺灣金錢橘的Kumquat 1(AY646511)和臍橙的LCd-NA-1(FJ355920)，聚合成一個小分支后，與分離于美國野檸檬的CTLV-ML (EU553489)組成一個大的分支。來自相同或相似寄主的分離物，無論地區(qū)和氣溫帶的差別，都具有同一的分支結(jié)構(gòu)，由此可見ASGV具有寄主的專化性和保守性。另外，盡管在同源性比較中，試驗中的ASGV cp基因與來自日本百合的L (D16681)和Li- 23(AB004063)同源率最高，但是在系統(tǒng)發(fā)育樹中卻聚合在不同的分支中，可見同源率不能完全反應(yīng)進化關(guān)系，同源率高不一定表現(xiàn)出保守性強?？紤]到在系統(tǒng)發(fā)育樹分析中，來自相同或相似寄主的分離物具有同一的進化分支，應(yīng)該認為系統(tǒng)發(fā)育樹分析比序列同源性分析更能反映ASGV病毒的進化和分化趨勢。

采用鄰近法構(gòu)建進化樹，自展值為1 000。AB004063和D16681:分離自日本百合的Li- 23和L，AY596172: 分離自韓國梨的ASGV-K，D14995:分離自日本蘋果的P-209，EU553489: 分離自美國野檸檬的CTLV-ML，AY646511和FJ355920: 分離自中國臺灣金錢橘的Kumquat 1和LCd-NA-1。

2.3 蛋白結(jié)構(gòu)分析

應(yīng)用ExPaSy (http://www.expasy.ch/)在線工具ProtParam分析表明：ASGV CP是由237個氨基酸殘基組成的27.13kD蛋白，等電點PI為7.67，酸性氨基酸殘基總數(shù)(Asp + Glu) 為34，堿性氨基酸殘基總數(shù)(Arg + Lys)為35。不穩(wěn)定系數(shù)是52.38，屬于不穩(wěn)定蛋白。分子式為C1219H1892N334O355S7，總平均親水性為-0.604，說明該蛋白是一個疏水蛋白。

用ExPaSy (http://www.expasy.ch/) 在線工具ProtScale(Hphob. / Kyte & Doolittle)對ASGV CP蛋白的疏水性/親水性進行預(yù)測，結(jié)果表明ASGV CP在氨基酸序列第60位的K有最大值：為1.733，疏水性最強；第100和101位T，E有最小值-2.933，親水性最強。在第12、44位、97～105位和202位極易形成親水區(qū)域，表明在該處可能形成抗原位點?？傮w來看, ASGV CP的大部分氨基酸都屬于疏水性氨基酸，整個多肽鏈表現(xiàn)為疏水性，與ProtParam分析結(jié)果一致。

通過簡單模塊構(gòu)架搜索工具(Simple Modular Architecture Research Tool，SMART，http://smart.embl-heidelberg.de)分析ASGV-CP蛋白結(jié)構(gòu)功能域，除了兩個低復雜度區(qū)域(low compositional complexity regions，LCR)外，未發(fā)現(xiàn)其他特異結(jié)構(gòu)功能域。

應(yīng)用GenBank在線工具Conversed Domain Database(CDD)對ASGV CP蛋白氨基酸序列進行保守結(jié)構(gòu)域分析，在第53-235位發(fā)現(xiàn)了纖毛病毒屬(Trichovirus)和葡萄病毒屬(Vitivirus)外殼蛋白保守結(jié)構(gòu)域，證實了ASGV病毒代表的發(fā)形病毒屬(Capillovirus)病毒與纖毛病毒屬(Trichovirus)和葡萄病毒屬(Vitivirus)病毒的同源關(guān)系，三者均為線形病毒科(Flexiviridae)成員[18]。

應(yīng)用在線軟件TMpred (http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)對ASGV CP氨基酸序列進行蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測，結(jié)果表明ASGV CP僅有一個跨膜螺旋的存在，在氨基酸第58-82位的25個氨基酸可能構(gòu)成由內(nèi)向外的跨膜區(qū)。推測ASGV CP不是一個跨膜蛋白質(zhì)。

2.4 二級結(jié)構(gòu)分析

應(yīng)用SWISS-MODEL及NPS@ (Network Protein Sequence Analysis)網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器(http://npsa-pbil.ibcp.Fr)在線軟件，選用HNN，MLRC，DSC，PHD和Predator等程序綜合分析ASGV-CP蛋白二級結(jié)構(gòu)，匯總為"一致預(yù)測結(jié)果"如圖2。分析結(jié)果顯示ASGV-CP蛋白其二級結(jié)構(gòu)由35.02% α-螺旋(Alpha helix，Hh)、10.55% β-片層(Extended strand，Ee)、47.26%無規(guī)則卷曲(Random coil，Cc)構(gòu)成。其中α-螺旋7個，β-片層5個，其余為無規(guī)則卷曲。

2.5 三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用自動比較蛋白建模服務(wù)器SWISS-MODEL ( http://swissmodel.expasy.org)對ASGV CP基因的氨基酸序列進行三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。SWISS-MODEL網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器是利用同源建模的方法構(gòu)建蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)。由于同源蛋白序列未知，故采用自動模式(Automated Mode)

由服務(wù)器自動選擇同源序列進行建模。然而輸出結(jié)果顯示服務(wù)器無法建立有效的結(jié)構(gòu)預(yù)測。比對查詢后發(fā)現(xiàn)，盡管在SWISS-MODEL關(guān)聯(lián)的EMBL-EBI數(shù)據(jù)庫中有ASGV-CP基因的同源序列纖毛病毒屬(Trichovirus)和葡萄病毒屬(Vitivirus)外殼蛋白序列(IPR008879 Coat_protein_tricho/vitivirus)，但是數(shù)據(jù)庫中并沒有這類蛋白質(zhì)已建立的蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)記錄。由于SWISS-MODEL是同源建模，推測同源序列數(shù)據(jù)的缺失是未能成功構(gòu)建ASGV-CP蛋白高級結(jié)構(gòu)的原因。

2.6 蛋白表達

重組質(zhì)粒pECASGV-CP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)plyss感受態(tài)細胞，經(jīng)IPTG誘導表達，菌體蛋白SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示：在分子量約為35kD處出現(xiàn)了表達量顯著增加的蛋白條帶，與預(yù)期值相符(圖3)。雖然非誘導的pECASGV-CP和空載體pET30a(+)在這一位置也出現(xiàn)了蛋白條帶，但是非常微弱，說明在該位置大腸桿菌有自身表達條帶，且表達量非常小。pECASGV-CP蛋白的表達覆蓋了該條帶的表達，誘導表達蛋白量顯著增加，表現(xiàn)為明顯的蛋白條帶。表明ASGV CP基因可以在大腸桿菌高效表達。

3 討論

蘋果莖溝病毒病屬于難治療病害。一方面，由于感病果樹在田間不表現(xiàn)出明顯的癥狀，使得該病害在田間的發(fā)生與流行不易被發(fā)現(xiàn)；另一方面，缺乏有效的藥物預(yù)防和治療該病害，使得感病果樹體內(nèi)的病毒無法得到有效控制。因此，針對該病害目前較為可行的控制措施是實行檢疫，控制其擴展。然而，在我國現(xiàn)有耕作制度下，果農(nóng)往往自發(fā)地繁殖，培育和嫁接蘋果樹，從而無意識地造成了蘋果莖溝病毒病的擴展。盡管建立高效靈敏的檢測技術(shù)，成為解決種苗檢疫、抗病性早期鑒定等基本問題的前提，也是果樹無毒化栽培的基本保障。然而高靈敏度的分子生物學檢測法，是通過檢測病毒核酸來證實病毒的存在[19]，并不適合于果農(nóng)生產(chǎn)的實際需要。血清學檢測方法簡單易行，上世紀80年代，ELISA已經(jīng)在國外應(yīng)用于蘋果無毒苗木生產(chǎn)體系中病毒的檢測, 大大提高了效率, 并節(jié)約了人力、物力[20-22]。然而，由于蘋果莖溝病毒在寄主體內(nèi)含量低，病毒粒體富于柔性，顆粒之間相互盤繞，給病毒提純帶來了一定困難,從而很難制備出高質(zhì)量的血清，同時血清學檢測又耗費大量的抗體材料，因此限制了應(yīng)用推廣[23]。以蘋果莖溝病毒外殼蛋白基因為材料，通過原核表達體系，獲得大量的病毒外殼蛋白基因的表達蛋白，可以為大量制備蘋果莖溝病毒抗血清，從而為實現(xiàn)蘋果莖溝病毒田間大規(guī)模，低成本檢測奠定基礎(chǔ)。

ASGV的研究已經(jīng)從初期的鑒定，檢測，進入到較為全面的階段，包括病毒基因組的測定與分析，病毒與寄主的關(guān)系等[4, 23, 24]。然而目前關(guān)于該病毒ORF的表達機制及基因功能的研究還較少。分析該病毒的表達機制及基因產(chǎn)物的功能，探明病毒在寄主體內(nèi)表達、增殖、移動及致病的分子機理，這將為該病害的研究和控制提供重要的理論基礎(chǔ)。

本研究結(jié)合了分子生物學試驗和生物信息學分析，克隆、表達了ASGV CP基因，分析了ASGV CP基因生物信息學數(shù)據(jù)，為進一步進行病毒基因的生物功能驗證奠定了基礎(chǔ)。