劉思婧，張瀟，李益，羅茂，吳劍波，李蓉△

皮膚是人體內(nèi)外環(huán)境的屏障，大面積燒傷、創(chuàng)傷、腫瘤切除手術(shù)等均會(huì)導(dǎo)致皮膚及其軟組織缺損，目前針對(duì)皮膚損傷的治療方法主要是皮膚移植，但是對(duì)于大面積皮膚缺損的患者，由于其自身皮源不足，使得創(chuàng)面治療非常困難［1］。富含血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）是靜脈血經(jīng)2 次梯度離心得到的血小板濃縮物［2］，其可在CaCl2、凝血酶等激活劑作用下形成凝膠，釋放多種高濃度促進(jìn)組織再生修復(fù)的生長(zhǎng)因子。因PRP 來(lái)源于自體，可刺激組織再生和早期愈合，不會(huì)致畸和誘發(fā)腫瘤［3］。本研究旨在通過(guò)建立小鼠皮膚創(chuàng)傷模型，觀察PRP 不同處理方式對(duì)皮膚創(chuàng)傷愈合的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 清潔級(jí)健康雄性C57BL/6J 小鼠27 只，10周齡，體質(zhì)量（27.48±1.20）g，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司（第一批購(gòu)買15 只，第二批購(gòu)買12 只）。所有小鼠飼養(yǎng)條件為晝夜各12 h 循環(huán)照明，溫度（22±3）℃，濕度（34±5）%，自由攝食和飲水。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative realtime PCR，qRT-PCR）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa 株式會(huì)社，Ⅰ型膠原α1 鏈（collagen type Ⅰ alpha 1 chain，COL1A1）、Ⅲ型膠原α1 鏈（collagen type Ⅲ alpha 1 chain，COL3A1）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-beta 1，TGF-β1）、血小板源性生長(zhǎng)因子（platelet derived growth factor，PDGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、PCR引物購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，凝血酶購(gòu)自Sigma 公司（美國(guó)），Ⅰ型膠原免疫熒光抗體（abcam，ab34710），Ⅲ型膠原免疫熒光抗體（abcam，ab7778），羊抗兔IgG二抗購(gòu)自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，無(wú)水CaCl2購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Thermo公司），熒光定量PCR 儀（美國(guó)BioRad 公司），熒光倒置相差顯微鏡（美國(guó)AMG公司），萊卡顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立 取15只小鼠，用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，背部脫毛，脫毛完成后俯臥位固定在手術(shù)操作臺(tái)上，將剔除毛發(fā)的背部皮膚用乙醇消毒后，再用生理鹽水對(duì)背部皮膚進(jìn)行擦拭，提拉皮膚中線，用直徑為5 mm的小圓刀切除全層皮膚至肌層表面，形成皮膚軟組織缺損創(chuàng)面。隨后將15只小鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，每組5只，依次為：（1）對(duì)照組。在圓形創(chuàng)緣按等距的6點(diǎn)皮下注射生理鹽水，每個(gè)注射點(diǎn)中注入0.1 mL，每只共計(jì)注射0.6 mL。（2）PRP 注射組。在圓形創(chuàng)緣按等距的6 點(diǎn)進(jìn)行皮下注射PRP，每個(gè)注射點(diǎn)中注入0.1 mL，每只共計(jì)注射0.6 mL。（3）PRP 凝膠組。每只準(zhǔn)備0.6 mL PRP，激活成凝膠覆蓋于創(chuàng)面。術(shù)后使用棉簽止血及油性紗布包扎，將各組小鼠單籠飼養(yǎng)，3 d后去除創(chuàng)面油性紗布，且未再給予藥物。

1.2.2 PRP凝膠的制備 1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉剩余的12只小鼠，用預(yù)先裝有0.1 mL ACD-A抗凝劑的1 mL注射器經(jīng)腹腔靜脈取血后，立即注入1.5 mL EP 管中，暫存于4 ℃的冰箱中。待所有小鼠采血完成后，置于低溫離心機(jī)中離心（4 ℃，100×g，10 min），此時(shí)血樣分為3層，上層為淡黃色上清液，中間為白細(xì)胞層，下層為紅細(xì)胞。小心吸取上層清液及中間層白細(xì)胞于新的EP 管中，再次置于低溫離心機(jī)中離心（4 ℃，1 600×g，10 min），吸走上層清液的3/4，輕輕混懸，即得到PRP。用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)獲取的PRP 中的血小板濃度為5 500×109個(gè)/L，為全血的5倍，說(shuō)明PRP制備成功。將得到的PRP 與激活劑（凝血酶與10%CaCl2的混合物）以9∶1 比例混合，常溫振蕩，5 min后即形成PRP凝膠。

1.2.3 創(chuàng)面形態(tài)觀察與測(cè)量 在術(shù)后當(dāng)天及術(shù)后第3、7、11、14 天進(jìn)行拍照，觀察傷口周圍的炎癥反應(yīng)、液體滲出以及傷口愈合情況；使用Image J 軟件，設(shè)定好標(biāo)尺，在需要測(cè)量的創(chuàng)面上進(jìn)行傷口邊緣勾畫，每只小鼠測(cè)量5次，求平均值計(jì)算傷口面積。

1.2.4 免疫熒光染色 小鼠術(shù)后第14天處死，取傷口處皮膚制成病理切片，經(jīng)過(guò)脫蠟、梯度乙醇水化、抗原修復(fù)、內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶消除、血清封閉后，切片用Ⅰ型膠原蛋白（1∶50）、Ⅲ型膠原蛋白（1∶50）抗體4 ℃過(guò)夜孵育，然后滴加羊抗兔IgG二抗，根據(jù)DAPI染色程度判定膠原蛋白的表達(dá)情況。

1.2.5 傷口處皮膚組織COL1A1、COL3A1、TGF-β1、PDGF、VEGF mRNA水平測(cè)定 取傷口處皮膚組織，采用Trizol法提取傷口處皮膚組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。按照 qRTPCR 反應(yīng)體系配置好后進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性5 s，50～60 ℃退火10 s，共39 個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。根據(jù)得出的熒光曲線的Ct 值，以β-actin 為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算結(jié)果。

Tab.1 Primer sequence for qRT-PCR表1 qRT-PCR所用引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用Graphpad prism 7.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理，結(jié)果以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較用Tukey法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PRP 凝膠對(duì)小鼠皮膚傷口閉合的影響 術(shù)后第3 天，PRP 凝膠組較另外2 組皮膚創(chuàng)面滲出液減少，傷口周圍干燥，且紅色肉芽組織開始生長(zhǎng)，傷口周圍上皮開始收縮。術(shù)后第11、14 天，PRP 凝膠組的皮膚傷口明顯愈合，見圖1。在術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)，與對(duì)照組和PRP 注射組相比，PRP 凝膠組傷口面積減?。≒＜0.05），術(shù)后第11、14 天，與對(duì)照組相比，PRP注射組傷口面積減?。≒＜0.05），見表2。

2.2 PRP 凝膠對(duì)膠原蛋白表達(dá)的影響 各組小鼠皮膚組織中Ⅰ型膠原蛋白與Ⅲ型膠原蛋白均陽(yáng)性表達(dá)。與對(duì)照組和PRP 注射組相比，PRP 凝膠組2 種膠原蛋白表達(dá)明顯增加，見圖2、3。

Tab.2 Comparison of wound areas at different time points between three groups of mice表2 3組小鼠皮膚損傷后不同時(shí)間點(diǎn)傷口面積比較（n=5，cm2，）

Tab.2 Comparison of wound areas at different time points between three groups of mice表2 3組小鼠皮膚損傷后不同時(shí)間點(diǎn)傷口面積比較（n=5，cm2，）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與PRP注射組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組PRP注射組PRP凝膠組F第3天0.22±0.01 0.21±0.01 0.14±0.01ab 267.200＊＊第7天0.20±0.01 0.19±0.01 0.10±0.01ab 432.900＊＊第11天0.18±0.01 0.15±0.01a 0.03±0.01ab 958.100＊＊第14天0.08±0.01 0.05±0.01a 0.02±0.01ab 119.900＊＊

2.3 小鼠皮膚傷口組織相關(guān)基因mRNA 表達(dá)水平比較 與對(duì)照組和PRP 注射組相比，PRP 凝膠組VEGF、COL1A1、COL3A1、TGF- β1 和 PDGF 的mRNA 表達(dá)水平均升高（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，PRP 注射組 COL1A1、COL3A1、TGF-β1、PDGF 的mRNA 表達(dá)水平均升高（P＜0.05），VEGF mRNA 表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

3 討論

皮膚缺損的修復(fù)過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜、動(dòng)態(tài)且有序的生物學(xué)過(guò)程，它包括起始的炎癥階段、肉芽組織增生、組織的重塑改建，這幾個(gè)階段相互關(guān)聯(lián)和相互影響［4］。在許多疾病中，一種或幾種機(jī)制受損可以導(dǎo)致愈合過(guò)程失敗，從而造成傷口難以愈合［5］，而傷口愈合延遲通常會(huì)導(dǎo)致局部感染加重［6］。

PRP 中血小板 α 顆粒含 PDGF、VEGF 等大量生長(zhǎng)因子，它們?cè)谘苄律约按龠M(jìn)細(xì)胞增殖等創(chuàng)傷組織進(jìn)行修復(fù)的環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用［7］。只有當(dāng)PRP被外源物激活以后，血小板α 顆粒中的各種生長(zhǎng)因子才會(huì)大量釋放，最終為細(xì)胞的黏附提供有利條件，從而上調(diào)Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)量［8］。PRP 凝膠相當(dāng)于給血小板穿上了保護(hù)衣，可保護(hù)血小板在體外不受損害，防止血小板的流失，使血小板在局部可以長(zhǎng)時(shí)間停留，分泌高濃度生長(zhǎng)因子，并且PRP凝膠還有一定的可塑性［9］。本研究結(jié)果表明，在小鼠的背部皮膚傷口給予PRP 凝膠可以明顯上調(diào)COL1A1、COL3A1 的 mRNA 表達(dá)，通過(guò)后續(xù)的免疫熒光結(jié)果也驗(yàn)證了激活PRP可以有效促進(jìn)膠原蛋白在傷口部位的合成。而未激活的PRP混懸液經(jīng)皮下注射后，對(duì)傷口愈合有一定促進(jìn)作用，但與激活PRP的作用比較，對(duì)傷口愈合作用的能力較弱。這也與PRP 激活后釋放大量活性因子的結(jié)果相一致。因此，筆者推測(cè)PRP 凝膠可能通過(guò)促進(jìn)膠原蛋白大量合成來(lái)加速傷口愈合。

Tab.3 Comparison of skin wound related genes between three groups of mice表3 3組小鼠皮膚傷口相關(guān)基因水平的比較（n=5，）

Tab.3 Comparison of skin wound related genes between three groups of mice表3 3組小鼠皮膚傷口相關(guān)基因水平的比較（n=5，）

＊＊P＜0.01；a與對(duì)照組比較，b與PRP注射組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組PRP注射組PRP凝膠組F VEGF 1.00±0.32 1.30±0.38 6.47±0.61ab 229.200＊＊COL1A1 1.00±0.20 3.62±0.65a 6.28±0.97ab 74.490＊＊組別對(duì)照組PRP注射組PRP凝膠組F COL3A1 1.00±0.02 1.98±0.25a 7.30±0.51ab 537.700＊＊TGF-β1 1.00±0.19 3.54±0.33a 9.83±0.88ab 337.100＊＊PDGF 1.00±0.60 3.74±0.63a 7.97±0.95ab 111.500＊＊

在皮膚傷口愈合過(guò)程中，血管化發(fā)揮著重要作用［10］，血管生成對(duì)于滋養(yǎng)新形成的肉芽組織和角質(zhì)細(xì)胞至關(guān)重要［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，給予小鼠皮膚傷口PRP凝膠可以誘導(dǎo)創(chuàng)傷組織中多種血管生成因子如TGF-β1、VEGF、PDGF mRNA 水平明顯升高。而PRP 注射組VEGF mRNA 表達(dá)水平與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且PRP注射組傷口面積在第11天才有明顯的減小。因此，筆者推測(cè)PRP 凝膠可能通過(guò)促進(jìn)血管生成來(lái)加速傷口愈合。

目前，臨床多使用單一生長(zhǎng)因子，僅能促進(jìn)某一階段的創(chuàng)面愈合過(guò)程。已有研究證實(shí)，將多種生長(zhǎng)因子組合使用，更符合創(chuàng)傷愈合的生物學(xué)過(guò)程，達(dá)到最佳的促進(jìn)創(chuàng)面愈合效果［12］。血小板激活后，可持續(xù)釋放多種與機(jī)體內(nèi)配比、種類類似的生長(zhǎng)因子［13］。本研究通過(guò)離心法成功制備PRP后混合加入適量的凝血酶和鈣離子，促使PRP 形成凝膠狀，即PRP 凝膠。與臨床上應(yīng)用的單一生長(zhǎng)因子相比，PRP 凝膠有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，其可為創(chuàng)面提供一個(gè)適合愈合的濕潤(rùn)環(huán)境，還能在創(chuàng)面愈合階段持續(xù)分泌高濃度生長(zhǎng)因子，發(fā)揮最大的促愈作用［14］。此外，PRP凝膠是由大量的纖維蛋白組成的立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可為細(xì)胞生長(zhǎng)提供良好支架，同時(shí)纖維蛋白的回縮作用還可以促進(jìn)創(chuàng)面收縮和凝血［15］。PRP凝膠可以是自源性的，避免了異種生長(zhǎng)因子可能引起的免疫排斥。近年來(lái)國(guó)外已有相關(guān)報(bào)道將其成功應(yīng)用于牙周病、口腔種植、顱面、骨關(guān)節(jié)軟骨等修復(fù)［16-17］，但應(yīng)用到皮膚創(chuàng)傷修復(fù)還并不成熟。本研究顯示，對(duì)照組傷口愈合速度最慢，愈合時(shí)間也最長(zhǎng)；PRP注射組愈合程度較對(duì)照組好；PRP凝膠組愈合程度最好，這證明了PRP制備為凝膠后可以促進(jìn)創(chuàng)面的修復(fù)。經(jīng)過(guò)PRP凝膠處理創(chuàng)面后，膠原蛋白大量生成，新生血管較多，瘢痕組織生成少，這些與PRP凝膠促愈作用以及能夠持續(xù)提供高濃度、與體內(nèi)配比相似的生長(zhǎng)因子均有關(guān)。但本研究沒有涉及不同濃度的PRP被激活以及PRP激活后釋放的生長(zhǎng)因子不同濃度配比對(duì)于皮膚傷口愈合的影響，有待更深入的研究。

綜上所述，使用PRP 凝膠可以顯著促進(jìn)傷口處膠原合成及新血管生成。同時(shí)，它可以為局部組織持續(xù)提供大量生長(zhǎng)因子，縮短創(chuàng)面愈合的時(shí)間。因此，PRP 凝膠有可能作為臨床治療皮膚創(chuàng)傷的一種有效手段。