何佩耕，薛超，黎偉，黃莉，彭茜，饒金蘭，李慧佳

原發(fā)性中性粒細(xì)胞胞漿抗體（anti-neutrophil cytoplasmic antibody，ANCA）相關(guān)性血管炎（ANCA-associated vasculitis，AAV）是一組與ANCA高度關(guān)聯(lián)的自身免疫性疾病?？衫奂叭碇行⊙埽鼙诔世w維素性炎癥壞死，且血管壁無(wú)或僅有少量免疫復(fù)合物沉積［1］。其分類包括顯微鏡下多血管炎、韋格納肉芽腫和嗜酸性肉芽腫多血管炎［2］。AAV的發(fā)病機(jī)制目前尚未闡明，現(xiàn)有研究表明其與環(huán)境、遺傳、感染、機(jī)體免疫狀態(tài)等因素相關(guān)［3］。自噬（autophagy）是普遍存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)高度保守的生命活動(dòng)，其依賴于溶酶體對(duì)細(xì)胞內(nèi)衰老受損的細(xì)胞器、錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)及其他大分子的降解-再利用的過(guò)程，對(duì)于細(xì)胞存活、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要意義［4］。已有研究報(bào)道自噬的異常參與了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、炎癥性腸病等自身免疫病及炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展［5］。然而，自噬相關(guān)基因ATG5 的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）在AAV中的遺傳學(xué)意義仍缺乏相關(guān)研究。本研究選取ATG5基因上10個(gè)SNP位點(diǎn)，探討其與廣西人群AAV的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究納入2005 年1 月—2019 年1 月于廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院確診為AAV 的住院及門(mén)診患者177 例（AAV 組）。AAV 患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)均參照2018 年增編的2012年Chapel Hill國(guó)際血管炎命名會(huì)議標(biāo)準(zhǔn)［2］，并且除外感染、藥物、惡性腫瘤等因素引起的繼發(fā)性血管炎和合并其他自身免疫性疾病的患者。對(duì)照組為同期在上述醫(yī)院體檢的健康志愿者216例。所有研究對(duì)象籍貫均為廣西。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2018第KY-0100號(hào)），并獲得所有研究對(duì)象知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集 收集一般資料包括籍貫、年齡、性別。臨床資料包括血紅蛋白、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血清白蛋白、血肌酐、C反應(yīng)蛋白（CRP）和紅細(xì)胞沉降率（ESR）。AAV組確診時(shí)的臨床癥狀資料包括發(fā)熱、水腫、血尿、咳嗽和咯血。

1.2.2 外周血收集和基因組DNA 提取 使用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管分別收集所有研究對(duì)象2 mL外周靜脈血，采用血液基因組DNA 提取系統(tǒng)DP319 試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)步驟提取外周血基因組DNA。提取的DNA經(jīng)Nanodrop2000［賽默飛世爾（中國(guó)）有限公司］檢測(cè)吸光度值（A260/A280）為1.7～1.9，質(zhì)量濃度＞25 mg/L，表示DNA 提取成功后，將DNA 分裝保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.3 ATG5 SNP 位點(diǎn)選取 SNP 位點(diǎn)選擇遵循以下策略：（1）該位點(diǎn)位于 ATG5 基因功能區(qū)。（2）標(biāo)簽 SNP。使用haploview 軟件從千人基因組計(jì)劃1000GENOME（http://grch37.ensembl.org/）獲取中國(guó)南方漢族人群（代碼CHS）和中國(guó)北京漢族人群（代碼CHB）ATG5 基因上存在的所有SNP后，從中篩選出標(biāo)簽SNP，作為本研究人群的標(biāo)簽SNP 的參考。（3）既往文獻(xiàn)報(bào)道的與自身免疫病或炎癥性疾病相關(guān)的SNP 位點(diǎn)。（4）SNP 位點(diǎn)的最小等位基因頻率≥0.05。最終挑選出 10 個(gè) SNP 位點(diǎn)，分別為 rs617994、rs1766193、rs656994、rs148316514、 rs573775、 rs662114、 rs510432、 rs506027、rs3761796、rs473543。

1.2.4 基因分型 基因分型采用多重聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增結(jié)合高通量測(cè)序方法［6］，在生工生物工程（上海）有限公司完成。具體步驟為：設(shè)計(jì)并合成好一個(gè)包含10個(gè)已挑選好的ATG5 基因SNP 位點(diǎn)的引物池，然后通過(guò)兩步PCR 的方法完成目標(biāo)SNP位點(diǎn)序列的擴(kuò)增和兼容Illumina測(cè)序文庫(kù)的制備。第一輪PCR體系如下：DNA模板（10 mg/L）2 μL；上游引物池（10 μmol/L）1 μL；下游引物池（10 μmol/L）1 μL；2×PCR Ready Mix 15 μL；RNase-free H2O 6 μL（總反應(yīng)體積25 μL）。配制好反應(yīng)體系后，在PCR儀（BIO-RAD，T100TM）上執(zhí)行以下反應(yīng)程序：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共8個(gè)循環(huán)；98 ℃變性30 s，66 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共25 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)完成后，4 ℃保存反應(yīng)產(chǎn)物，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，確定產(chǎn)物大小正確，使用AMPure XP 磁珠純化回收PCR 產(chǎn)物。以第一輪PCR產(chǎn)物為模板執(zhí)行第二輪PCR反應(yīng)，以獲得測(cè)序文庫(kù)。反應(yīng)體系如下：第一輪PCR產(chǎn)物（10 mg/L）2 μL，通用 P7 引物（10 μmol/L）1 μL；通用 P5 引物（10 μmol/L）1 μL；2×PCR Ready Mix 15 μL；RNase-free H2O 11 μL（總反應(yīng)體積30 μL）。配制好反應(yīng)體系后，執(zhí)行如下PCR程序：98 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共5 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，反應(yīng)完成后4 ℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。最終PCR 產(chǎn)物使用AMPure XP 磁珠純化回收。各個(gè)PCR 產(chǎn)物等量混合后，使用HiSeq XTen 測(cè)序儀（Illumina，San Diego，CA）進(jìn)行測(cè)序。擴(kuò)增各SNP的引物序列見(jiàn)表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用方差分析，偏態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，采用K-W 秩和檢驗(yàn)，多重比較后的組間兩兩比較采用Bonferroni 校正法；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用Pearsonχ2檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法。等位基因頻率和基因型頻率的計(jì)算、Hardy-Weinberg 平衡（HWE）檢驗(yàn)抽樣對(duì)象的群體代表性、SNP位點(diǎn)間連鎖不平衡分析、單倍體頻率及其與疾病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系的分析，均通過(guò)SHEsis 在線軟件（http://analysis.bio-x.cn）完成。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Tab.1 Primer sequences of SNP in multiple PCR表1 多重PCR擴(kuò)增SNP位點(diǎn)引物池的引物序列

2 結(jié)果

2.1 研究人群人口學(xué)特征及比較 AAV 組177 例中男 68 例，女 109 例，年齡 19～73 歲，平均（53.90±15.01）歲；對(duì)照組 216 例中男 84 例，女 132 例，年齡18～81 歲，平均（51.35±12.65）歲，2 組平均年齡（t=1.795）及性別構(gòu)成（χ2=0.009）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

2.2 2組人群各SNP位點(diǎn)基因型及等位基因頻率的比較 除rs506027在對(duì)照組中有1例樣本分型不成功外，10個(gè)ATG5基因SNP位點(diǎn)在全部393個(gè)樣本中分型成功，rs617994 在AAV 組和對(duì)照組中出現(xiàn)3 個(gè)等位基因 A、G、T，A 堿基的頻率小于0.05（AAV 組0.020，對(duì)照組0.012），可能是由于突變所致，考慮到SNP 位點(diǎn)絕大多數(shù)為雙等位位點(diǎn)，故在分析該位點(diǎn)時(shí)將攜帶A 堿基的例數(shù)剔除，在此僅分析G、T 等位基因。2 組樣本所有位點(diǎn)的基因型頻率均符合Hardy-Weinberg 平衡定律，因此可認(rèn)為研究人群具有群體代表性。AAV 組與對(duì)照組10 個(gè)ATG5 基因SNP位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率比較顯示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

2.3 SNP位點(diǎn)間連鎖不平衡及單體型分析 10個(gè)ATG5基因SNP位點(diǎn)在研究對(duì)象中構(gòu)建了6個(gè)常見(jiàn)單體型（頻率＞0.03），見(jiàn)表3。取連鎖不平衡系數(shù)D'≥0.8認(rèn)為兩SNP存在強(qiáng)連鎖不平衡，傾向整體遺傳。除rs473775與rs1766193未呈現(xiàn)出連鎖不平衡外（D'=0.06），其余SNP間均呈現(xiàn)出連鎖不平衡，所有10個(gè)SNP位點(diǎn)均處于同一個(gè)單體型區(qū)塊（haplotype block）中（D'為0.84～1.00），見(jiàn)圖1。各單體型之間AAV發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表4。

2.4 AAV 患者各SNP 位點(diǎn)基因型臨床資料的比較 rs1766193、rs148316514的3種基因型患者中水腫的發(fā)生率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，rs1766193 的3 種基因型中發(fā)熱的發(fā)生率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但經(jīng)兩兩比較發(fā)現(xiàn)各基因型間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（經(jīng)Bonferroni 法校正P＞0.016 7），其余SNP 位點(diǎn)基因型的各臨床癥狀的發(fā)生率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表5。AAV 患者中rs617994 的3 種基因型患者的血清白蛋白水平，rs656994 的3 種基因型患者的血肌酐水平，rs510432、rs506027、rs473543 的 3 種基因型患者的血清白蛋白及ESR 水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余SNP位點(diǎn)基因型的各實(shí)驗(yàn)室檢查項(xiàng)目差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表6。

3 討論

3.1 AAV 與自噬基因ATG5 AAV 病例相對(duì)罕見(jiàn)，臨床漏診及誤診時(shí)有發(fā)生，其自然病程預(yù)后差，常由于快速進(jìn)展的肺、腎功能損害導(dǎo)致嚴(yán)重后果甚至死亡。近年來(lái)，診斷水平的提高和免疫抑制治療的應(yīng)用使AAV逐漸成為一種慢性復(fù)發(fā)性疾病，因此復(fù)發(fā)及長(zhǎng)期免疫抑制治療的不良反應(yīng)成為影響AAV 患者預(yù)后的主要因素。加強(qiáng)對(duì)本病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)有助于預(yù)防及改進(jìn)治療方法。目前認(rèn)為遺傳因素是AAV主要發(fā)病機(jī)制之一。

Tab.2 Comparison of genotypic and allelic frequencies of SNP loci between control and AAV groups表2 2組人群中各SNP位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率分布比較

續(xù)表2

Tab.3 Common haplotypes composed of 10 SNPs表3 10個(gè)SNP構(gòu)成的常見(jiàn)單體型

自噬幾乎參與了病原微生物的清除、抗原提呈、抗體產(chǎn)生、免疫細(xì)胞發(fā)育分化、炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生等免疫系統(tǒng)活動(dòng)的各個(gè)過(guò)程。自噬過(guò)程涉及一系列自噬基因的調(diào)控，ATG5 基因是自噬的主要調(diào)控基因，其位于染色體6q21，長(zhǎng)度約230 kb，包含10個(gè)外顯子，其蛋白質(zhì)通過(guò)與ATG12、ATG16L1 形成二聚體調(diào)控自噬體的生成［4］。大量研究表明自噬的紊亂與多種人類自身免疫性疾病和炎癥性疾病相關(guān)。研究顯示，外周血中各類單個(gè)核細(xì)胞，如 T 細(xì)胞［7］、漿細(xì)胞［8］、樹(shù)突狀細(xì)胞和B細(xì)胞［9］中自噬的改變密切參與了自身免疫性疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)生發(fā)展。You 等［10］報(bào)道 ATG5 基因 rs473542 和 rs510432 與再生障礙性貧血存在關(guān)聯(lián)。Pham 等［11-12］的研究也提示ATG5 基因rs506027 與成人哮喘氣道炎癥、敗血癥等有關(guān)。近年來(lái)，Sha等［13-14］的研究提示自噬參與了AAV發(fā)病過(guò)程的重要環(huán)節(jié)，即中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)形成的過(guò)程。因此筆者推測(cè)自噬基因ATG5上SNP位點(diǎn)的多態(tài)性可能與AAV具有關(guān)聯(lián)性。

3.2 與AAV 患者臨床表現(xiàn)相關(guān)的SNP 位點(diǎn) 在本研究中，經(jīng)Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)10個(gè)SNP 位點(diǎn)在廣西人群中具有多態(tài)性，但2 組間10 個(gè)SNP中的等位基因頻率和基因型頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此未采用非條件Logistic回歸進(jìn)行基因型與發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系的分析。而此10 個(gè)SNP 在所納入研究樣本中構(gòu)成6個(gè)常見(jiàn)的單體型，在2組間的分布差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示本研究納入的10個(gè)SNP位點(diǎn)可能與廣西AAV人群的遺傳易感性無(wú)關(guān)。

Tab.4 Effects of haplotype on AAV表4 單體型對(duì)AAV的影響 頻數(shù)（%）

Tab.5 Comparison of clinical symptoms between genotypes of 10 SNP loci in patients with AAV表5 AAV患者10個(gè)SNP位點(diǎn)各基因型臨床癥狀比較 例（%）

對(duì)AAV患者的臨床資料分析顯示，rs148316514各基因型中水腫、rs1766193各基因型中發(fā)熱及水腫的發(fā)生率存在差異，但經(jīng)多重比較發(fā)現(xiàn)各基因型組間兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮是經(jīng)Bonferroni法校正過(guò)于保守，且在患者中rs148316514 的TT 基因型僅為 2 例，rs1766193 的 GG 基因型僅為 5 例，兩個(gè)亞組例數(shù)較少，還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本庫(kù)后再行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，避免假陽(yáng)性的發(fā)生。

實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果顯示，rs617994 位點(diǎn)3 個(gè)基因型的血清白蛋白水平，rs510432、rs506027、rs473543位點(diǎn)各自3 個(gè)基因型的血清白蛋白、ESR 以及rs656994 位點(diǎn)3 個(gè)基因型的血肌酐水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rs510432、rs506027、rs473543這3個(gè)位點(diǎn)均位于ATG5 基因的5'區(qū)啟動(dòng)子，呈現(xiàn)出完全連鎖不平衡狀態(tài)，只構(gòu)成2 種單體型T-G-A 與C-A-G（rs510432-rs506027-rs473543）。Martin 等［15］發(fā)現(xiàn)，rs510432與ATG5基因啟動(dòng)子的活性顯著相關(guān)，其可能與兒童哮喘有關(guān)。而自噬在自身免疫性疾病時(shí)可介導(dǎo)機(jī)體的炎癥活動(dòng)［16］，如在炎癥腸病中，自噬參與調(diào)控了炎癥小體的激活，自噬的缺乏會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞釋放大量炎性因子［17］。由此筆者推測(cè)，在AAV患者中不同的基因型和單體型影響了ATG5基因后續(xù)的轉(zhuǎn)錄以及翻譯，并影響了自噬過(guò)程，從而改變了炎癥細(xì)胞聚集及炎性因子的釋放，進(jìn)而導(dǎo)致了ESR 的差異。體內(nèi)炎癥活動(dòng)的程度可能與腎臟的損害相關(guān)，導(dǎo)致血清白蛋白水平改變，這有待應(yīng)用熒光定量PCR 測(cè)定不同基因型及單體型患者ATG5 基因表達(dá)量及后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。而rs617994和rs656994位點(diǎn)位于ATG5 基因的內(nèi)含子區(qū)域，且尚未見(jiàn)關(guān)于該兩位點(diǎn)的文獻(xiàn)報(bào)道，筆者推測(cè)可能是由于該兩位點(diǎn)參與了ATG5基因表達(dá)的調(diào)控過(guò)程引起了相應(yīng)指標(biāo)的變化，但仍需后續(xù)實(shí)驗(yàn)探究。

Tab.6 Correlation analysis of between genotypes of 10 SNP loci and laboratory index in patients with AAV表6 AAV患者10個(gè)SNP位點(diǎn)各基因型與實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)關(guān)聯(lián)性分析

3.3 本研究的意義及可能存在的缺點(diǎn) 本研究探討了自噬相關(guān)基因ATG5與自身免疫性疾病AAV的關(guān)系，為AAV 的遺傳學(xué)病因及防治提供了依據(jù)，但也存在以下不足：（1）樣本含量相對(duì)較少。（2）樣本來(lái)源于住院以及門(mén)診患者，門(mén)診檢查不完善，導(dǎo)致臨床資料有所缺失，影響后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析。（3）由于樣本主要來(lái)自于廣西醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，抽樣上可能存在選擇偏倚。因此仍需要擴(kuò)大樣本量，完善臨床資料，在多地區(qū)多人群中進(jìn)行更加深入研究。

綜上所述 ，ATG5 基因 rs617994、rs1766193、rs656994、rs148316514、rs510432、rs573775、rs662114、rs506027、rs3761796、rs473543位點(diǎn)基因多態(tài)性在廣西人群普遍存在，rs1766193多態(tài)性可能與發(fā)熱和水腫發(fā)生有關(guān)，rs148316514 多態(tài)性可能與水腫發(fā)生有關(guān)，rs617994多態(tài)性可能與血清白蛋白水平有關(guān)，rs510432、rs506027、rs473543多態(tài)性可能與血清白蛋白及ESR有關(guān)，rs656994多態(tài)性與血肌酐水平有關(guān)，但上述10個(gè)SNP的多態(tài)性可能與廣西人群AAV的遺傳易感性無(wú)關(guān)聯(lián)。