焦文強(qiáng) 邢廣旭 劉運(yùn)超 徐引弟 王治方 王克領(lǐng) 李海利

摘要：為了解豬流行性腹瀉病毒（PEDV）新流行毒株的遺傳變異情況，本研究對2014—2018年間采集的205份PEDV疑似陽性樣品進(jìn)行RT-PCR檢測、擴(kuò)增PEDV S2基因并進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化分析。RT-PCR結(jié)果顯示，205份疑似陽性樣品中有191份擴(kuò)增出單一條帶，片段大小為1 887 bp，符合S2基因的擴(kuò)增預(yù)期。試驗(yàn)樣品陽性檢出率為93.17%。測序分析表明，試驗(yàn)共獲得25株S2基因序列，與參考毒株之間核苷酸的同源性為94.3%～99.6%，氨基酸的同源性為86.4%～96.2%。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，試驗(yàn)得到的PEDV毒株分屬于G1、G2亞群。本研究為PEDV防控以及疫苗毒株篩選奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒;S2基因;克隆;進(jìn)化分析;陽性檢出率

中圖分類號：S852.65+1 ?文獻(xiàn)標(biāo)識號：A ?文章編號：1001-4942（2020）02-0106-05

Abstract In order to investigate molecular evolution of porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） in China， a total of 205 samples including fecal and intestine tissues were collected in 2014—2018 from Henan， Hebei， Shandong， Shanxi， Gansu， Hubei and Jiangxi Provinces. All the samples were subject to RT-PCR and the positive samples were sequenced to obtain the whole S2 gene. The single band with the fragment size as 1 887 bp was amplified from 191 samples， and the positive detection rate was 93.17%. In all， 25 S2 gene sequences were acquired; their nucleotide homology with the control strain were 94.3%～99.6%， and their amino acid homology with the control strain were 86.4%～96.2%. The evolution analysis results indicated that the obtained PEDV strains belonged to the G1 and G2 subgroups. This study could provide informations for the control and prevention of PEDV.

Keywords Porcine epidemic diarrhea virus; S2 gene; Cloning; Evolution analysis; Positive detection rate

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea， PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus， PEDV）感染引起的一種豬的高度接觸性病毒傳染病，臨床表現(xiàn)為嘔吐、水樣腹瀉以及脫水等，最終可致豬脫水死亡[1]。該病最早由英國學(xué)者發(fā)現(xiàn)，后蔓延至歐洲其它國家[2-4]。20世紀(jì)90年代，亞洲地區(qū)開始報道PEDV的流行[5，6]。我國學(xué)者宣和于1984年成功分離PEDV病毒。長期以來，該病毒在我國主要以散發(fā)形式存在，直到2010年，從南部省份迅速傳播到主要生豬養(yǎng)殖省份，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[7]。2013年美國暴發(fā)PED，至此，PEDV呈現(xiàn)全球分布[8]。

PEDV屬于冠狀病毒科（Coronaviridae）、冠狀病毒屬（Coronavirus），其核酸類型為單股正鏈RNA，長度約為28 kb。 基因組由5′非編碼區(qū)（untranslated region， UTR）、3′UTR以及7個開放閱讀框組成（open reading frames， ORFs），分別編碼3個非結(jié)構(gòu)蛋白（non-structural proteins， NSPs）和4個結(jié)構(gòu)蛋白（structural proteins， SPs），即S蛋白、E蛋白、M蛋白和N蛋白[9]。其中，S蛋白在PEDV吸附宿主細(xì)胞、誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體方面發(fā)揮重要作用，S蛋白可以分為S1（第1～789位氨基酸）和S2（第790～1 383位氨基酸）兩部分。Park 等[10]研究發(fā)現(xiàn)S2基因不僅在膜融合過程中發(fā)揮重要作用，其編碼的1 368～1 374位氨基酸也是重要的表位之一。因此，深入分析S2蛋白的遺傳變異情況對于了解PEDV的抗原位點(diǎn)變化，以及相應(yīng)病毒毒力的影響等都具有重要作用。

為深入了解PEDV在我國遺傳變異情況，本研究對2014年10月至2018年3月采集到的205份PEDV疑似病料進(jìn)行RT-PCR檢測，擴(kuò)增陽性樣品的S2基因序列并測序，旨在為指導(dǎo)臨床PEDV的防控工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料采集

本研究于2014年10月至2018年3月從河南、河北、山東、山西、甘肅等省區(qū)采集疑似PEDV病料205份，包括仔豬小腸組織、糞便以及母豬血液等，并進(jìn)行分類編碼。其中，糞便用PBS稀釋離心取上清，小腸組織加入PBS研磨后離心取上清用于檢測。所有樣品均置于-80℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

Taq DNA 聚合酶、鼠源反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）、RNA 酶抑制劑、pMD18-T Simple 載體、DL2000 Marker、JM109感受態(tài)細(xì)胞、RNA提取試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司;膠回收試劑盒、小型質(zhì)粒提取試劑盒購自于天根公司;瓊脂糖購自O(shè)xoid公司，其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計

參考GenBank中收錄的PEDV毒株S基因序列，GenBank登錄號分別為KF272920、KF468752、KC196276、JX188454、KC210145。使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，上游引物：5′-GGTTTCTTCTACCATTCTAATGACG -3′，下游引物：5′-TCGCTCGAGTCACTGCACGTGGAC-3′，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 PEDV S2基因的克隆與測序

按照寶生物RNA提取試劑盒操作說明書完成疑似樣品的RNA提取，隨即合成cDNA。反應(yīng)體系包括5×NLV反轉(zhuǎn)錄緩沖液2 μL、dNTP 2 μL、MLV反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL、RNA酶抑制劑0.3 μL和總RNA 4.9 μL，充分混勻后置離心機(jī)瞬時離心混勻，反應(yīng)條件為42℃ 1.5 h、70℃ 10 min。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：Taq DNA 聚合酶1 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各 1 μL，dNTP 4 μL，10×PCR Buffer （Mg2+ plus） 5 μL，無菌雙蒸水補(bǔ)足 50 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min;94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 2 min，35個循環(huán);72℃延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，回收與預(yù)期大小一致的PCR產(chǎn)物，并與pMD18-T Simple載體連接，4℃過夜后轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選后挑取單克隆進(jìn)行培養(yǎng)并提取質(zhì)粒送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。使用MegAlign軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEDV S2 基因的擴(kuò)增

利用PCR技術(shù)對205份待檢樣品進(jìn)行PEDV S2基因擴(kuò)增，得出191份樣品可擴(kuò)增出單一條帶，片段大小為1 887 bp，符合預(yù)期。部分?jǐn)U增結(jié)果如圖1所示。

2.2 205份臨床樣品PEDV檢出率

205份臨床樣品中，有191份樣品檢測為PEDV陽性，陽性率高達(dá)93.17%。其中，小腸的陽性率最高（176/185，陽性率為95.14%）;其次為糞便（11/13，陽性率為84.62%）。各種臨床樣品的陽性率詳見表1。

2.3 PEDV S2基因的分析

經(jīng)測序分析，本研究共得到S2基因序列25株，S2基因全長1 887個核苷酸，共編碼625個氨基酸。其中，CH-HENPY-2015株在第18～27核苷酸之間存在10個核苷酸的插入（圖2），CH-HENKF-2017在第1 774～1 809核苷酸之間存在36個核苷酸的缺失（圖3）。具體這2株毒株核苷酸的插入和缺失對病毒毒力的影響有待于進(jìn)一步研究。本研究得到的S2基因與參考毒株之間核苷酸的同源性為94.3%～99.6%，氨基酸的同源性為86.4%～96.2%（圖4）。

2.4 S2基因遺傳進(jìn)化分析

使用本研究得到的S2基因序列與GenBank中下載的序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)得到的25株毒株中CH-HENXY-2018、CH-HENPY-2015、CH-SHANGH-2017和CH-HENXX-2017株與CV777、LZC等毒株屬于G1亞群，剩余的21株與今年分離的PC22A、MN等毒株同屬于G2亞群（圖5）。

3 討論與結(jié)論

目前關(guān)于PEDV的遺傳進(jìn)化情況，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行過很多研究，但是相關(guān)報道主要集中在S1基因、ORF3基因，對S2基因的遺傳進(jìn)化情況鮮有報道。本研究從2014—2018年間采集的PEDV疑似樣品中共得到25株S2基因。這些基因序列與國內(nèi)外參考毒株相比，核苷酸的同源性為94.3%～99.6%，氨基酸的同源性為86.4%～96.2%，表明氨基酸的突變造成了其編碼的氨基酸序列的改變，使得PEDV的變異情況更加復(fù)雜。其中CH-HENPY-2015株在第18～27核苷酸之間存在10個核苷酸的插入，CH-HENKF-2017在第1 774～1 809核苷酸之間存在36個核苷酸的缺失，這些核苷酸的缺失和插入對于病毒毒力以及免疫原性的影響等方面需要更近一步驗(yàn)證。

遺傳進(jìn)化分析顯示，CH-HENXY-2018、CH-HENPY-2015、CH-SHANGH-2017和CH-HENXX-2017株與CV777、LZC等毒株同屬于G1亞群，其余21株病毒與PC22A、MN、IA1毒株屬于G2亞群。說明PEDV進(jìn)化趨勢沿著不同方向，未來需要更多的毒株、更廣泛的來源加以分析。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] Jung K， Saif L J. Porcine epidemic diarrhea virus infection： etiology， epidemiology， pathogenesis and immunoprophylaxis[J]. The Veterinary Journal， 2015， 204（2）： 134-143.

[2] Wood E N. An apparently new syndrome of porcine epidemic diarrhoea[J]. Veterinary Record， 1977， 100（12）：243-244.

[3] Nagy B， Nagy G， Meder M， et al. Enterotoxigenic Escherichia coli， rotavirus， porcine epidemic diarrhoea virus， adenovirus and calici-like virus in porcine postweaning diarrhoea in Hungary[J]. Acta Vet. Hung.， 1996， 44： 9-19.

[4] Smíd B， Valícek L， Rodák L， et al. Detection of porcine epidemic diarrhea virus using electron microscopy in the Czech Republic[J]. Vet. Med.， 1993， 38：333-341.

[5] Takahashi K， Okada K， Ohshima K. An outbreak of swine diarrhea of a new-type associated with coronavirus-like particles in Japan[J]. The Japanese Journal of Veterinary Science， 1983， 45（6）： 829-832.

[6] Song D， Park B. Porcine epidemic diarrhoea virus： a comprehensive review of molecular epidemiology， diagnosis， and vaccines[J]. Virus Genes， 2012， 44： 167-175.

[7] Li R， Qiao S， Yang Y， et al. Genome sequencing and analysis of a novel recombinant porcine epidemic diarrhea virus strain from Henan， China[J]. Virus Genes， 2016， 52：91-98.

[8] Stevenson G W， Hoang H， Schwartz K J. et al. Emergence of porcine epidemic diarrhea virus in the United States： clinical signs， lesions， and viral genomic sequences[J]. Vet. Diagn. Invest.， 2013， 25：649-654.

[9] Woo P C Y， Huang Y， Lau S K P， et al. Coronavirus genomics and bioinformatics analysis [J]. Viruses， 2010， 2：1804-1820.

[10] Park S J， Moon H J， Luo Y， et al. Cloning and further sequence analysis of the ORF3 gene of wild- and attenuated-type porcine epidemic diarrhea viruses[J]. Virus Genes， 2008， 36： 95-104.