姚玉榮 霍建飛 郝永娟 劉春艷 王萬(wàn)立

摘要：本研究從番茄根結(jié)中分離得到一株根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的內(nèi)生生防真菌Wx103，經(jīng)鑒定為Acremonium sclerotigenum。該菌株發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)具有較強(qiáng)的毒殺活性，發(fā)酵液處理24 h后的校正死亡率為90.25%，處理7 d對(duì)卵孵化抑制率為41.04%;盆栽試驗(yàn)中孢子液處理線(xiàn)蟲(chóng)防效為68.72%，與3%阿維菌素微囊懸浮劑處理無(wú)顯著差異。本研究豐富了根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)生物防治的微生物資源，可為該菌株的開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：內(nèi)生真菌;根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng);Wx103;防效

中圖分類(lèi)號(hào)：S476.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A ?文章編號(hào)：1001-4942（2020）02-0101-05

Abstract A strain of endophytic fungus Wx103 was screened from tomato with high efficacy against root knot nematode and was identified as Acremonium sclerotigenum. Its fermentation solution had stronger lethal activity against the two-instar larva， and the corrected mortality was 90.25% after treated for 24 hours. Furthermore， the Wx103 strain exhibited higher ovicidal efficacy of 41.04% after treated for 7 days. In the pot experiment， the root galls caused by Meloidogyne incognita decreased by 68.72%， which was not significantly different from 3% abamection micro-capsule SC. The finding of the study enriched the microbial resources against root-knot nematode， and provided references for development and utilization of this strain.

Keywords Endophytic fungus; Root-knot nematode; Wx103; Control effect

根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)（Meloidogyne spp.）是一類(lèi)主要侵染植物的病原微生物，也是世界各國(guó)對(duì)外檢疫的重要對(duì)象，它給全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)了極大危害[1]。自1932年首次報(bào)道番茄根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病害發(fā)生以來(lái)，我國(guó)發(fā)生省區(qū)已超過(guò)十個(gè)。近年來(lái)保護(hù)地蔬菜的迅猛發(fā)展加速了該病害的發(fā)生，致使該病害成為限制保護(hù)地蔬菜發(fā)展的主要因素，防控形勢(shì)相當(dāng)嚴(yán)峻[2]。

植物內(nèi)生真菌是指生活史的某一階段或者全部階段生活在健康植物組織內(nèi)部，但并不引起宿主植物病害癥狀的一類(lèi)真菌[3]。內(nèi)生真菌能夠通過(guò)提高寄主植物抗性、改變寄主植物對(duì)病蟲(chóng)害的應(yīng)答反應(yīng)來(lái)提高寄主植物對(duì)逆境及病蟲(chóng)害的抵抗。內(nèi)生真菌防治植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)具有明顯優(yōu)勢(shì)，其存活于植物體內(nèi)，可避免與土壤微生物競(jìng)爭(zhēng)，并與寄生線(xiàn)蟲(chóng)處于相似的生態(tài)位，能夠更充分地發(fā)揮作用，從而提高生物防治微生物的靶向性和高效性。 West等[4]研究表明，內(nèi)生尖孢鐮刀菌Fosurium oxysporum能夠顯著降低南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)（Meloidogyne incognita）對(duì)番茄的侵染率，與對(duì)照相比線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)量減少36.0%～55.9%。根部?jī)?nèi)生真菌印度梨形孢（Piriformospora indica）不僅能夠顯著降低大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)的種群密度，還能提高寄主植物生物和非生物抗性[5]。目前已經(jīng)報(bào)道的防治線(xiàn)蟲(chóng)的內(nèi)生真菌主要從屬于枝孢霉屬（Acremonium）[4，6]、毛殼菌屬（Chaetomium）[7]、鐮刀菌屬（Fusarium）[8-10]、黑盤(pán)孢屬（Melanconium）[11]、青霉菌屬（Penicillium）[12]、擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis）[11]等。生產(chǎn)中根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的防治通常采用化學(xué)農(nóng)藥防治、生物防治及抗病品種利用等，化學(xué)農(nóng)藥主要包括阿維菌素、噻唑膦等。

本研究擬從番茄根結(jié)中分離根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)生防菌，繼而對(duì)篩選得到的生防菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，再分別利用菌株發(fā)酵液浸泡和盆栽試驗(yàn)測(cè)定其對(duì)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的防治效果，以期為根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病的防治提供新的生防資源。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

番茄根結(jié)樣品采集地點(diǎn)為天津市武清區(qū)下伍旗溫室大棚。該棚種植番茄多年，根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病發(fā)病嚴(yán)重。

1.2 真菌菌株Wx103的分離鑒定

采用常規(guī)組織分離法。將新鮮的番茄根結(jié)清洗干凈，用無(wú)菌刀片削除根結(jié)表皮，0.5%次氯酸鈉浸泡30 s，無(wú)菌水清洗3次，滅菌紙吸干水分后切成小塊，再置于含有0.1 g/L氨芐青霉素的PDA培養(yǎng)基上。之后于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，待長(zhǎng)出菌絲后進(jìn)行單孢純化，并將分離得到的菌株保存?zhèn)溆?。其中，一株真菌命名為Wx103。

依據(jù)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法分別對(duì)菌株 Wx103進(jìn)行鑒定。參考《中國(guó)真菌志》進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，分子生物學(xué)鑒定則采用ITS序列分析。將分離得到的菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，置于25℃培養(yǎng)，收集菌絲，后用CTAB法提取總DNA。利用真菌ITS序列通用引物ITS1（ITS1： 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4 （ITS4： 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[13]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：2×EsTaq Master Mix（Dye）25 μL，上下游引物各2 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 19 μL。擴(kuò)增程序：94℃ 4 min;94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 50 s，共35個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送天津金唯智生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用BLAST進(jìn)行同源性分析，并通過(guò)MEGA 5.0軟件用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，在分子水平上鑒定菌株種類(lèi)。

1.3 Wx103發(fā)酵液的制備

挑選PDA平板上生長(zhǎng)良好的菌落，取直徑0.5 cm的菌餅接種于含PDB的三角瓶中，28℃、120 r/min培養(yǎng)5 d得到真菌發(fā)酵液，再經(jīng)5 000 r/min離心15 min，得發(fā)酵上清液（以下稱(chēng)發(fā)酵原液）。

1.4 南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)卵及其二齡幼蟲(chóng)J2的制備

南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)來(lái)源于天津市植物保護(hù)研究所蔬菜病害室。將感染南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的辣椒苗病根洗凈，解剖鏡下挑取新鮮卵塊，用0.5% NaClO表面消毒，清水洗凈。一部分卵塊經(jīng)0.5% NaClO振蕩解離后，收集游離卵制備卵懸浮液（每毫升卵量約1 000個(gè)），另一部分卵在28℃孵化出南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)J2。

1.5 Wx103發(fā)酵液對(duì)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)毒力測(cè)定

1.5.1 對(duì)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)卵的生物活性 試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)處理，分別為：Wx103發(fā)酵原液、陽(yáng)性對(duì)照（3%阿維菌素微囊懸浮液稀釋2 000倍）、對(duì)照（無(wú)菌水）。取100 μL濾液于96孔板的小孔中，每處理加入約100個(gè)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)卵，重復(fù)3次。置25℃孵化，于3、5、7 d統(tǒng)計(jì)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)孵化量，計(jì)算卵孵化抑制率：

抑制率（%）=（對(duì)照線(xiàn)蟲(chóng)孵化量-處理線(xiàn)蟲(chóng)孵化量）/對(duì)照線(xiàn)蟲(chóng)孵化量×100 。

1.5.2 對(duì)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)的生物活性 處理設(shè)置同1.5.1，采用觸殺法進(jìn)行殺線(xiàn)蟲(chóng)活性測(cè)定。取100 μL濾液于96孔板的小孔中，每處理加入約100條南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)，重復(fù)5次，置25℃培養(yǎng)，分別于24、48 h后統(tǒng)計(jì)死亡線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)量（將線(xiàn)蟲(chóng)在清水中恢復(fù)2 h，線(xiàn)蟲(chóng)僵直，針刺不動(dòng)視為死亡），計(jì)算校正死亡率：

校正死亡率（%）=（處理死亡率-對(duì)照死亡率） /（1-對(duì)照死亡率） ×100 。

1.6 Wx103孢子液對(duì)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)防效的盆栽鑒定

將菌株Wx103接種于200 mL PDB溶液（含有100 mg/mL氨芐青霉素鈉）中，28℃、150 r/min恒溫培養(yǎng)3 d后，過(guò)濾菌絲，收集孢子，統(tǒng)計(jì)孢子濃度并將其調(diào)至107 cfu/mL。每千克土加入100 mL菌液，混勻。待番茄幼苗兩片真葉完全展開(kāi)后移栽到拌好孢子液的土壤中，14 d后每株接線(xiàn)蟲(chóng)1 000條，每處理15株，重復(fù)3次。接種線(xiàn)蟲(chóng)45 d后清洗番茄根部，根據(jù)蔬菜根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)根結(jié)情況，計(jì)算菌株對(duì)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的防效[14]：

防效=（空白對(duì)照根結(jié)數(shù)-處理根結(jié)數(shù)）/空白對(duì)照根結(jié)數(shù)×100% 。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)， SAS 9.1軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

試驗(yàn)用菌株Wx103在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后，菌落呈現(xiàn)白色（圖1）。

通過(guò)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，分離菌株在進(jìn)化樹(shù)上與枝孢霉Acremonium sclerotigenum isolate HB2同源性達(dá)到99.8%（圖2），結(jié)合菌株形態(tài)特征，將菌株鑒定為Acremonium sclerotigenum strain Wx103。

2.2 Wx103發(fā)酵原液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)卵的生物活性

由圖3可以看出，與對(duì)照（抑制率為零）相比，發(fā)酵原液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)卵囊孵化具有抑制作用。發(fā)酵原液處理3 d對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)卵囊孵化的抑制率達(dá)到70.06%，但顯著低于3%阿維菌素微囊懸浮劑處理的抑制率92.09%;處理5、7 d時(shí)，發(fā)酵液對(duì)卵孵化的抑制率分別為57.02%和41.04%，均顯著低于同期的3%阿維菌素微囊懸浮劑處理。

2.3 Wx103發(fā)酵原液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)二齡幼蟲(chóng)J2的生物活性

由圖4可以看出，菌株Wx103發(fā)酵原液處理根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)J2，其24 h的校正死亡率達(dá)到90%以上，與3%阿維菌素微囊懸浮劑處理的致死活性相當(dāng)。發(fā)酵原液稀釋2、4、10倍后，殺線(xiàn)蟲(chóng)活性并未顯著降低，表明真菌Wx103發(fā)酵原液中含有高效殺線(xiàn)蟲(chóng)活性物質(zhì)。

2.4 Wx103孢子液對(duì)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)防效的盆栽試驗(yàn)

由圖5可以看出，Wx103孢子液處理的番茄根結(jié)平均數(shù)量為28.55個(gè)，3%阿維菌素微囊懸浮劑處理的為23.71個(gè)，對(duì)照則高達(dá)91.29個(gè)。孢子液和3%阿維菌素微囊懸浮劑處理對(duì)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的防效分別為68.72%和74.09%，兩者并無(wú)顯著差異（圖6）。觀察發(fā)現(xiàn)，孢子液處理的番茄根結(jié)數(shù)量少、根系發(fā)達(dá)、植株健壯，而對(duì)照根結(jié)較多、須根少，這表明菌株Wx103不僅能夠降低根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的侵染，同時(shí)能夠促進(jìn)番茄生長(zhǎng)。

3 討論與結(jié)論

大多數(shù)內(nèi)生真菌對(duì)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的影響是通過(guò)產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物作用于線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)的酶系或代謝反應(yīng)抑制或者殺死線(xiàn)蟲(chóng)[15]。內(nèi)生尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum FO162發(fā)酵液處理線(xiàn)蟲(chóng)60 min后，90%的線(xiàn)蟲(chóng)喪失活力，處理24 h后的線(xiàn)蟲(chóng)死亡率高達(dá)100%[8]。Schwarz等[11]報(bào)道了內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)生的3-Hydroxypropionic acid物質(zhì)對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的毒殺活性。Tian等[16]利用從番茄根結(jié)上分離的內(nèi)生真菌交枝頂孢Acremonium implicatum處理南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)48 h后，線(xiàn)蟲(chóng)死亡率可達(dá)96%以上，盆栽試驗(yàn)中該菌株對(duì)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的防效達(dá)到66.7%。Kpcke等[17]證實(shí)內(nèi)生子囊菌代謝產(chǎn)生的次級(jí)代謝物內(nèi)酯類(lèi)化合物對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)具有良好的致死活性。

本研究從番茄根結(jié)中分離得到一株內(nèi)生真菌，經(jīng)鑒定為Acremonium sclerotigenum，其發(fā)酵液對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)J2具有較強(qiáng)毒性，能夠抑制根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)卵囊孵化。盆栽試驗(yàn)結(jié)果顯示該菌株孢子液顯著降低了根結(jié)數(shù)量，對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)的防治效果與3%阿維菌素微囊懸浮劑相當(dāng)?？梢酝茰y(cè)在菌株孢子液中存在對(duì)南方根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)具有較強(qiáng)毒性的代謝產(chǎn)物，這種物質(zhì)多為次級(jí)代謝產(chǎn)物。因此，番茄內(nèi)生真菌Acremonium sclerotigenum strain Wx103對(duì)根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)具有生防作用，在后續(xù)的研究中應(yīng)深入挖掘發(fā)酵液中活性的物質(zhì)成分，為該菌株生防菌劑的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

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