毛鳳鑫 葛超 李豪圣 王燦國 韓冉 程敦公 李法計(jì) 孫福來 趙振東 劉愛峰

摘要：前期通過對(duì)耐旱小麥的RNA-Seq分析發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄本TRIAE_CS42_3DL_TGACV1_252817_AA0892160在干旱脅迫下表達(dá)量下降;通過克隆、生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該轉(zhuǎn)錄本包含一個(gè)444 bp的完整編碼區(qū)，編碼147個(gè)氨基酸，蛋白結(jié)構(gòu)分析其含有一個(gè)UBC結(jié)構(gòu)域，與山羊草泛素結(jié)合酶（E2）的氨基酸序列完全一致，證明該基因?yàn)榉核亟Y(jié)合酶（E2）基因（TaUCE2）。蛋白序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)其第7、91、144位置處的氨基酸在單雙子葉植物之間是特異的。進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)該基因是在單雙子葉植物進(jìn)化后期分化的。熒光定量PCR分析表明，該基因響應(yīng)ABA、干旱、高鹽、低溫的脅迫，在四種脅迫下，該基因在根中的表達(dá)量均降低。本研究為進(jìn)一步分析泛素蛋白酶體途徑在小麥逆境響應(yīng)中的功能和機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：小麥;泛素結(jié)合酶（E2）;TaUCE2;逆境脅迫

中圖分類號(hào)：S512.1：Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A ?文章編號(hào)：1001-4942（2020）02-0001-06

Abstract The RNA-Seq analysis result showed that the expression level of transcript TRIAE_CS42_3DL_TGACV1_252817_AA0892160 decreased under drought stress. It was found that the transcript contained one gene whose CDS was 444 bp based on cloning and bioinformatics analysis. The protein encoded by this gene contained 147 amino acids and had a UBC domain. The amino acid sequence of this protein was the same as ubiquitin binding enzyme （E2） in Aegilops tauschii， which indicated that this gene belonged to the ubiquitin binding enzyme gene （TaUCE2）. Protein sequence alignment revealed that the amino acids at position 7， 91 and 144 were specific between monocotyledonous and dicotyledonous plants. Evolutionary analysis showed that the gene was differentiated in the later stage of monocotyledonous and dicotyledonous plant evolution. Real-time PCR analysis showed that TaUCE2 was response to ABA， drought， high salt and low temperature， and its expression level in root was down-regulated under the four kinds of stress. This study could provide a foundation for further function and mechanism analysis of ubiquitin proteasome pathway in wheat stress response.

Keywords Wheat; Ubiquitin-conjugating enzyme （E2）;TaUCE2; Abiotic stress

非生物脅迫包括干旱、鹽堿等，是影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素。植物在長期進(jìn)化過程中形成了一套響應(yīng)外界脅迫的信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)。其中，蛋白質(zhì)泛素化途徑在維持細(xì)胞功能、抵御脅迫等方面發(fā)揮重要作用。植物會(huì)因?yàn)槊{迫產(chǎn)生異常蛋白影響細(xì)胞的代謝，而植物泛素化途徑可以有效去除這些異常蛋白，使細(xì)胞正常代謝[1]。

蛋白質(zhì)泛素化在真核生物的許多生理過程中至關(guān)重要，大量研究表明，植物通過泛素-蛋白酶體途徑降解靶蛋白，從而維持自身正常的生長發(fā)育及代謝調(diào)控過程[2]。泛素化過程是通過將泛素加到靶蛋白上的泛素激活酶（E1）、泛素結(jié)合酶（E2）和泛素連接酶（E3）依次作用來實(shí)現(xiàn)的[3-5]。其中泛素結(jié)合酶（E2）在E1和E3之間起橋梁作用。E2通過與特定的E3相互作用將泛素連接到靶蛋白上[6-8]。另外，E2還通過影響多聚泛素鏈的空間結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)泛素途徑中的底物[9-10]。因此對(duì)泛素結(jié)合酶（E2）的研究具有重要意義。

泛素結(jié)合酶（E2）約由150個(gè)氨基酸組成，含有UBC結(jié)構(gòu)，且第85個(gè)氨基酸為半胱氨酸，該Cys可與ATP激活的泛素蛋白共價(jià)結(jié)合形成硫酯鍵。擬南芥E2基因主要參與抗逆、DNA修復(fù)、雌配子發(fā)育、開花的調(diào)節(jié)[11-13]。近年來，泛素結(jié)合酶E2在提高植物抗性方面的研究已成為一個(gè)熱點(diǎn)[14]。

本研究室在耐旱小麥轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)一個(gè)轉(zhuǎn)錄本TRIAE_CS42_3DL_TGACV1_252817_AA0892160，該轉(zhuǎn)錄本在重度干旱脅迫下的表達(dá)量僅為對(duì)照的一半，說明該轉(zhuǎn)錄本響應(yīng)干旱脅迫。通過克隆、序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄本編碼泛素結(jié)合酶（E2）。為了更深入了解小麥泛素結(jié)合酶（E2）基因（TaUCE2）的功能，本研究克隆了耐旱小麥濟(jì)麥262中的TaUCE2基因，并對(duì)其蛋白序列進(jìn)行了分析，通過熒光定量分析了該基因在非生物脅迫條件下的表達(dá)模式，為深入研究該基因參與小麥抗逆調(diào)控的機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本研究以山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院抗旱節(jié)水小麥品種濟(jì)麥262為材料，選取飽滿種子，置于直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，于光照培養(yǎng)箱中25℃恒溫培養(yǎng)3 d后，選擇生長狀態(tài)一致的幼苗移栽到塑料培養(yǎng)盒中，1/2 Hogland培養(yǎng)液培養(yǎng)至兩葉一心時(shí)，用于非生物脅迫處理。干旱處理：將材料置于含 20% PEG-6000的水溶液中生長;鹽脅迫處理：將待處理材料置于含250 mmol/L NaCl水溶液中生長;ABA處理：將待處理材料置于含100 μmol/L ABA的水溶液中生長;低溫處理：將待處理材料置于4℃培養(yǎng)箱中生長。分別于處理0、3、6、12、24、48 h時(shí)取根、莖、葉部位材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品RNA的提取及cDNA的合成 樣品RNA的提取采用RNA提取試劑盒（大連寶生物工程有限公司）按操作說明進(jìn)行。取檢測濃度適宜及完整度較好的RNA為模板進(jìn)行cDNA合成。試驗(yàn)步驟按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生物工程有限公司）操作說明進(jìn)行。合成后的cDNA保存在-20℃中備用。

1.2.2 TaUBE2基因的克隆 利用引物TaUCE2F （5′-CAGACAGCGAGCAAAGGA-3′，位于起始密碼子上游170～187處），TaUCE2R （5′-GCAGGTGGCGACATTTATC-3′，位于終止密碼子下游164～182處），以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，利用高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pEASY-Blant載體上，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，挑取6個(gè)陽性菌落送于青島擎科生物公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果利用DNAMAN軟件進(jìn)行分析。

1.2.3 基因的生物信息學(xué)分析 利用DNAMAN軟件將DNA序列翻譯成蛋白序列并通過在線軟件ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）、TMHMM進(jìn)行分析（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）推定蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。不同物種間進(jìn)化樹的構(gòu)建使用軟件MEGA 7.0進(jìn)行。

1.2.4 熒光定量PCR分析 使用羅氏公司的LightCycler 480Ⅱ進(jìn)行熒光定量PCR檢測TaUCE2的表達(dá)模式。利用TaUCE2基因的特異引物（F： 5′-GCAGGCAACAATAATGGG-3′， R： 5′-GTGGGCGATCTCAGGAAC-3′）。反應(yīng)體系20 μL，含2×Taq PCR MasterMix（含熒光染料） 10 μL，10 μmol/L引物各0.5 μL，cDNA模板0.5 μL，ddH2O 8.5 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性5 min;95℃變性20 s，56℃退火25 s，72℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。以小麥Actin基因作為內(nèi)參（F：5′-AAGTACAGTGTCTGGATTGGAGGG-3′，R：5′-TCGCAACTTAGAAGCACTTCCG-3′）。每個(gè)處理時(shí)期3次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3個(gè)試驗(yàn)重復(fù)，利用2-ΔΔCT法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaUCE2基因的克隆和序列分析

2.1.1 TaUCE2基因的克隆 以干旱脅迫處理的濟(jì)麥262根系cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得了813 bp的擴(kuò)增片段（圖1），將該片段連接到克隆載體上進(jìn)行測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其包括444 bp的完整編碼區(qū)。將編碼區(qū)序列在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與山羊草的泛素結(jié)合酶E2基因的相似度達(dá)到98%（NCBI登錄號(hào)XM_020329095.1），認(rèn)為該基因?yàn)樾←湻核亟Y(jié)合酶E2，將該基因暫命名為TaUCE2。

2.1.2 TaUCE2編碼蛋白序列分析 利用DNAMAN軟件將TaUCE2翻譯成蛋白，發(fā)現(xiàn)其編碼147個(gè)氨基酸。將此氨基酸序列在ExPASy-PROSITE和SMART進(jìn)行保守域分析，發(fā)現(xiàn)該基因包含一個(gè)典型的UBC結(jié)構(gòu)域。蛋白酶活性位點(diǎn)位于74～89位的15個(gè)氨基酸殘基以及85位的半胱氨酸殘基，與其他物種的泛素結(jié)合酶序列完全匹配，說明TaUCE2具有半胱氨酸催化位點(diǎn)和結(jié)合酶的活性，屬于泛素結(jié)合蛋白家族成員（圖2）。

通過在線軟件TMHMM對(duì)TaUCE2蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)TaUCE2蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)。該蛋白的等電點(diǎn)為7.69，相對(duì)分子量為1656 kD，不穩(wěn)定系數(shù)為43.09，屬于不穩(wěn)定蛋白。

將目前已報(bào)道的不同物種的UCE2蛋白與預(yù)測的小麥UCE2蛋白進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其與山羊草序列相同，與二穗短柄草和水稻僅有3個(gè)氨基酸的不同，相似度達(dá)到97.3%。不同植物間的UCE2蛋白的氨基酸序列相似度高達(dá)97%，說明該蛋白具有較高的保守性。另外，第7、91、144位置的氨基酸在單子葉植物中是Q、D和R，而在雙子葉植株中分別為L、E和K（圖2箭頭所示），表明該3個(gè)位點(diǎn)的氨基酸是單雙子葉植物所特異的。

系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，單子葉植物和雙子葉植物各自聚為一類（圖3），表明該蛋白在單雙子葉植物進(jìn)化后期才進(jìn)行的分化。

2.2 TaUCE2基因在非生物脅迫下應(yīng)答分析

TaUCE2基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)受ABA、干旱、鹽和低溫的影響（圖4）。受四種脅迫的影響，TaUCE2基因在根中的表達(dá)量均下降，其中在ABA和干旱脅迫下，該基因在根中的表達(dá)趨勢一致，均為在脅迫后6 h內(nèi)表達(dá)量持續(xù)下降，從6 h到12 h有小幅上升，但從12 h之后又開始下降直至24 h時(shí)最低，之后又有小幅上升。在鹽和低溫脅迫下，該基因在根中的表達(dá)是在3 h內(nèi)降低，從3 h到12 h有小幅上升，從12 h之后又開始降低直至24 h降到最低，之后又有小幅上升。最終，該基因在根中的表達(dá)量與未處理相比是降低的。

在四種脅迫下，該基因在葉和莖部的表達(dá)不同于在根中的表達(dá)，除低溫脅迫下的葉片，該基因在葉和莖部的表達(dá)量在處理3 h內(nèi)，與未處理相比均增高。在處理24 h時(shí)，該基因的表達(dá)量與未處理相比降低到整個(gè)處理時(shí)間段的最低。在低溫處理下，葉中該基因在處理3 h時(shí)表達(dá)量降低，這可能與該基因在低溫響應(yīng)中的代謝方式有關(guān)。以上結(jié)果表明，TaUCE2基因受干旱、ABA、鹽、低溫的誘導(dǎo)。

3 討論與結(jié)論

本研究對(duì)根據(jù)耐旱小麥轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)的在干旱脅迫下表達(dá)量顯著下調(diào)的基因（TRIAE_CS42_3DL_TGACV1_252817_AA0892160）進(jìn)行了克隆、序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該基因?yàn)榉核亟Y(jié)合酶（E2）基因（TaUCE2）。泛素結(jié)合酶（E2）的特征為包含一個(gè)由150個(gè)左右的氨基酸殘基形成的UBC結(jié)構(gòu)域，這個(gè)區(qū)域中有一個(gè)保守的半胱氨酸殘基可與被ATP激活的 Ub蛋白共價(jià)結(jié)合形成硫酯鍵[15]。利用DNAMAN軟件對(duì)該序列進(jìn)行翻譯，發(fā)現(xiàn)其編碼147個(gè)氨基酸，包含一個(gè)典型的UBC結(jié)構(gòu)域。蛋白酶活性位點(diǎn)位于74～89位，且第85位為半胱氨酸，序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)其與其他物種的泛素結(jié)合酶對(duì)應(yīng)的序列完全匹配，說明TaUCE2具有半胱氨酸催化位點(diǎn)和結(jié)合酶的活性，屬于泛素結(jié)合蛋白家族成員。

蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)TaUCE2蛋白與山羊草UCE2蛋白序列完全一致，與其他物種蛋白序列之間的相似度也達(dá)到97%，說明該蛋白序列具有較高的保守性，另外發(fā)現(xiàn)在該蛋白的第7、91、144位置處的氨基酸在單雙子葉植物之間是特異的。進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)單雙子葉植物各聚為一類，說明該蛋白的分化是發(fā)生在單雙子葉分化形成之后。

泛素結(jié)合酶作為植物泛素/蛋白酶體系統(tǒng)的主要成分，在植物的生長發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白運(yùn)輸以及生物或非生物脅迫應(yīng)答中均起到了重要作用。張雅文等[16]發(fā)現(xiàn)大豆E3泛素連接酶基因GmAIRP1通過提高抗氧化酶活性以及積累滲透調(diào)節(jié)增強(qiáng)植物的抗旱與抗鹽能力。棉花的E3泛素連接酶基因GhRING1-like通過調(diào)控ABA而調(diào)控植物的抗旱能力[17];水茄E2泛素結(jié)合酶基因StUBCc與黃萎病菌有關(guān);擁有泛素連接酶活性的擬南芥AtPUB18基因參與非生物脅迫[18]。為了進(jìn)一步確定該基因與逆境脅迫的關(guān)系，利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）的方法，分析了TaUCE2在非生物脅迫處理下的動(dòng)態(tài)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TaUCE2基因在干旱、ABA、鹽、低溫脅迫下表達(dá)量均發(fā)生了變化，特別是在根中，該基因在四種脅迫下一直處于下調(diào)表達(dá)狀態(tài)，表明TaUCE2能夠參與逆境脅迫響應(yīng)，可能在提高小麥抗逆性中發(fā)揮重要作用。

參 考 文 獻(xiàn)：

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