章天驕 王亞東

摘要：對于多細胞真核生物來說，細胞的特異性功能是十分重要的。這就要求在相同遺傳物質的基礎上，細胞能夠通過不同的基因表達模式來適應環(huán)境的變化。基因表達調控的因素有很多，近年來隨著對基因組非編碼區(qū)的研究，發(fā)現了一些非編碼的DNA序列對于基因表達調控具有重要意義。增強子是對基因表達調控具有重要作用的非編碼序列元件之一。一些增強子能夠通過轉錄產生具有調控功能的RNA，也被稱為增強子RNA（enhancer RNA，eRNA）。因此對于增強子的序列特征、作用位點以及在特定時間和特定組織中表達模式的研究成為了基因表達調控領域的一個重要問題。

關鍵詞： 增強子; eRNA; 基因表達調控

【Abstract】 Specific function of cells is very important for multicellular eukaryotes. Despite the same genetic material， cells can adapt to environment changes through different gene expression patterns. There are many factors in gene expression regulation. In recent years， with the study of genomic non-coding region， it has been found that some non-coding DNA sequences are important for gene expression regulation. Enhancers are one of the non-coding sequence components that play an important role in gene expression regulation. Some enhancers can be transcribed into RNA with regulatory function， also known as enhancer RNA （eRNA）. Therefore， the study on enhancer sequence features， target genes， and expression patterns in specific time and specific tissues has become an important issue in the field of gene expression regulation.

【Key words】 ?enhancer; eRNA; gene expression regulation

0引言

增強子是DNA序列上增強基因表達的順式調控元件，通常位于轉錄起始位點較遠的位置。與啟動子不同，增強子對基因表達的調控作用具有高度明顯的組織特異性。增強子對基因表達的調控不是“開關”模式，而是一種可變調控，即影響基因表達量的高低，而不是直接關閉或開啟表達的調控方式[1]。

增強子最初于1981年由Banerji和Moreau等人在猿猴空泡病毒40（SV40）的基因組中被發(fā)現[2]。1983年在小鼠免疫重鏈基因中發(fā)現了第一個非病毒的增強子[3]。哺乳動物中增強子的數目為50 000到100 000個。大部分增強子位于內含子區(qū)和基因間區(qū)，少部分位于外顯子區(qū)[4]。在相近的基因組區(qū)域內多個增強子聚集成簇的現象被稱為超級增強子或增強子簇。研究發(fā)現其橫跨很大的基因組區(qū)同時富集了大量的轉錄因子及轉錄中介復合物[5]。超級增強子經常位于細胞特異性功能基因的附近，并且富含細胞特異性轉錄因子結合序列模體。雖然超級增強子被廣泛應用于多個研究中，但是卻沒有一個清晰的定義[6]。

[BT4]1增強子概述

增強子通過與其目標基因啟動子相互作用實現對基因的表達調控。這種相互作用，可能是順式（in cis）作用，也可能是反式（in trans）作用。順式作用是指增強子及其作用位點基因在同一條染色體上，反式作用則指增強子及其作用位點基因在不同的染色體上[7]。目前對增強子調控基因表達有2種模型，如圖1所示[8]。第一種是軌道調控模型，即RNA聚合酶II及其轉錄復合物沿著DNA軌道從增強子到啟動子滑動。雖然這種模型在一些例子中被證實是存在的[9]，但過去二三十年的研究更加支持另一種模型。第二種模型是環(huán)狀調控模型，增強子通過染色質成環(huán)現象與其調控基因的啟動子區(qū)域相互臨近[10]。圖2顯示了增強子通過染色質成環(huán)與啟動子臨近調控基因表達的現象[11]。

增強子內部包含多種遺傳標記位點，最常見的是轉錄因子結合位點。轉錄因子與轉錄復合物的輔助激活因子p300/CBP通過相互作用富集在增強子區(qū)域內。這些與轉錄因子結合的區(qū)域內核小體的結合度顯著下降，導致容易被脫氧核糖核酸酶I（Deoxyribonuclease I，簡稱DNase I）剪切。這些核小體缺失區(qū)域（Nucleosome-depleted Regions，NDRs）兩側被特殊的組蛋白修飾所標記，例如H3K4me1和H3K27ac。H3K4me1與不活躍和活躍的增強子均相關聯，H3K27ac只與活躍的增強子相關聯。圖3顯示了增強子內部常見的遺傳標記[1]。

第一次發(fā)現增強子的轉錄現象是在β-珠蛋白的基因座控制區(qū)（Locus Control Region，LCR），隨著高通量測序技術的廣泛應用，增強子的轉錄被發(fā)現是一種普遍現象。2010年，Kim等人[12]對小鼠的中樞神經細胞中剔除rRNA后的其它RNA測序時，發(fā)現了增強子RNA的雙向轉錄現象。這種由增強子經過轉錄過程表達出的RNA為eRNA。這個發(fā)現使得人們認識到增強子區(qū)域不僅富集轉錄因子，更是一個轉錄激活區(qū)。與之前的研究一致，增強子區(qū)域同樣富集轉錄起始復合物，例如RNA聚合酶II[13]。

eRNA的長度通常較長，因此eRNA經常被認為是長非編碼RNA（Long Noncoding RNA，lncRNA）的子集。然而，一部分eRNA卻不在lncRNA的數據庫中[14]。造成這種現象有2層原因，其一是eRNA通常是通過其轉錄區(qū)域具有增強子遺傳標記所發(fā)現的[14]，而lncRNA則是根據其長度大于200 bp所定義的[14];其二是eRNA由于其不穩(wěn)定性或者表達量較低沒能被構建lncRNA數據庫的方法所識別[14]。由于這種現象導致eRNA和lncRNA存在交集，故而將交集部分定義為lnc-eRNA。

eRNA作為一種新的轉錄單元，與其它的轉錄單元既有相似性也有不同之處。圖4列出了4種常見的轉錄單元[8]。其中，啟動子上游轉錄區(qū)（Promoter Upstream Transcripts，PROMPTs）由于與eRNA具有相似的性質而被單獨列出來。這四種常見轉錄單元的部分性質及特征對比見表1[8]。

2增強子預測

對于增強子預測的研究是所有相關增強子研究的基礎問題。只有在基因組上識別出增強子所在的位置后，才能對增強子的其它性質及功能進行研究。大量的研究使用了不同的生物數據來預測增強子的位置。這些生物數據主要分為5種類別，詳述如下。

（1）使用了序列保守性數據和轉錄因子結合位點數據進行計算學分析。Woolfe等人[15]、Pennacchio等人[16]和Visel等人[17]對不同物種間非編碼元件進行保守性分析來預測增強子。其中，Pennacchio等人[16]對人類和紅鰭東方鲀的基因組進行了序列比對，找到保守的非編碼區(qū)域。然后對這些區(qū)域進行模式序列的搜索，找到2個物種共有的具有增強基因表達程度的模式序列。然后，對于所有未知功能的保守非編碼區(qū)域進行打分，對應數學公式可寫為：

Wasserman等人[18]將轉錄因子結合位點和保守性分析相結合，對不同物種的非編碼區(qū)域進行分析來預測增強子。這對于已知結合序列模式信息的轉錄因子能夠很好地預測其結合的基因組位置，但同時也包含了其它非增強子的與轉錄因子結合的調控元件序列，因此結果具有很高的假陽性。

（2）使用了調控因子的結合數據，包括轉錄因子的ChIP-seq數據和轉錄輔激活物p300的ChIP-seq數據。Chen等人[19]和Zinzen等人[20]使用了轉錄因子的ChIP-seq數據來預測增強子。Chen等人[19]使用了13種轉錄因子（Nanog，Oct4，STAT3，Smad1，Sox2，Zfx，c-Myc，n-Myc，Klf4，Esrrb，Tcfcp2l1，E2f1和CTCF）和2種轉錄調控元件（p300和Suz12）對胚胎干（Embryonic Stem，ES）細胞的轉錄調控網絡進行構建。這種方法能夠識別那些與已知轉錄因子結合的增強子。但是這種方法需要知道具體的轉錄因子來進行實驗設計。同時也不能區(qū)分增強子和啟動子區(qū)域，因為這些區(qū)域都會結合轉錄因子。另一方面也不是所有的增強子都與轉錄因子相結合。

Visel等人[21]和May等人[22]使用了轉錄輔激活物p300的ChIP-seq數據來預測增強子。Visel等人[21]對全基因組p300的ChIP-seq數據進行分析得到了p300的富集位置。然后針對這些p300富集的位置是否具有增強子活性進行檢測，發(fā)現約88%的位置具有增強子的活性。并且發(fā)現這些p300富集的位置大多是保守的。這種方法被廣泛地應用于增強子位置的預測，但對于活躍的增強子和不活躍的增強子的區(qū)分效果不好。

（3）是與染色質的可及性（Chromatin Accessibility）相關的數據。染色質的可及性是指染色質纏繞的核小體從致密變?yōu)樗缮ⅲ瑢е罗D錄調控元件可以順利結合到其上面起調控作用的性質。應用染色質的可及性來識別增強子主要有以下3種技術。Dorschner等人[23]使用了脫氧核糖核酸酶I超敏感位點測序（DNase I Hypersensitive Sites Sequencing，DNase-seq）數據。Giresi等人[24]使用了甲醛輔助分離調控元件測序（Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements Sequencing，FAIRE-seq）數據。Buenrostro等人[25]使用了轉座酶可及染色質測序（Assay for Transposase-accessible Chromatin Sequencing，ATAC-seq）數據。DNase-seq需要使用大量的細胞用于實驗，而ATAC-seq需求的細胞量則很少，同時實驗周期也相對較短。但是應用染色質可及性數據進行預測同樣也會使結果存在假陽性，即會有其他轉錄調控單位，例如啟動子、隔離子和沉默子等被包含進結果中。

（4）是組蛋白修飾數據。Heintzman等人[26]應用了H3K4me1和H3K27ac來預測增強子的位置，這兩種組蛋白修飾前者是與增強子特定相關，后者則是與激活的調控區(qū)相關，同時應用這兩種組蛋白修飾預測得到的基因組調控區(qū)域便是激活的增強子區(qū)域。此外還有多種組蛋白修飾與DNA序列調控元件的關聯關系：H3K4me3與啟動子相關聯，H3K4me2與啟動子和增強子都相關，H3K9ac也與激活的調控區(qū)相關，H3K36me3和H4K20me1與轉錄區(qū)相關，H3K27me3與多梳抑制區(qū)域相關等。這種預測方法的優(yōu)點是不同物種間組蛋白修飾數據來源廣泛，能夠有效地輔助不同需求的研究，缺點是全基因組范圍內組蛋白修飾信號十分廣泛，不利于高精度預測增強子位置。

（5）是基于eRNA數據進行預測。上文中已經提到，增強子會轉錄出eRNA，這部分eRNA通過測序技術被檢測到再映射回原基因組就能得到增強子的位置信息。Kim等人[12]使用了RNA-seq技術，這種技術的優(yōu)點是eRNA和其附近的基因表達水平可以同時被量化，缺點是低表達水平的eRNA不會被檢測到。Lai等人[27]，Melgar等人[28]，Mayer等人[29]分別使用了染色質關聯RNA測序（Chromatin-associated RNA-seq，ChAR-seq）、GRO-seq和NET-seq技術來檢測eRNA，這三種技術的優(yōu)勢是都可以檢測不穩(wěn)定的eRNA。Andersson等人[30]使用了CAGE技術來檢測eRNA。這種技術的優(yōu)點在于可以高精度地確定eRNA的轉錄起始位點，缺點是對于檢測表達量較低的eRNA需要的樣本量較大。同時所有基于eRNA數據確定增強子位置的方法都不能用于預測未表達的增強子。

綜上，不同的增強子預測方法在本質上是使用了增強子附近不同的生物信號數據。圖5比較了不同增強子識別方法的差異[31]。

3增強子作用位點預測

增強子的作用位點指的是增強子對基因表達起增強作用。這種作用體現在增強子與基因的啟動子區(qū)域相互作用，從而調控基因的表達。通常認為增強子與啟動子的相互作用是通過物理上的成環(huán)結構實現的。這種物理上的近鄰會募集多種轉錄因子和轉錄輔助因子結合到增強子和啟動子區(qū)域。而這些轉錄因子等則會吸引RNA聚合酶從而引起轉錄的發(fā)生。因此要研究一個增強子的生物學功能，確定其作用位點是至關重要的。目前對于增強子作用位點的研究主要分為2類方法：基于生物學實驗的方法和基于計算學的方法。隨著生物實驗技術的進步，從生物學實驗的角度來研究增強子的作用位點變得準確可靠，但實驗成本也隨之增高?；谟嬎銓W的方法雖然不如實驗方法準確，但其高通量的特性和較低的實驗成本能夠很好地輔助生物學實驗的進行。

由于基于生物實驗的方法預測增強子作用位點的成本較高，因此需要計算學方法的輔助。近年來由于生物信息學的發(fā)展，一系列基于不同增強子特征的計算學預測方法被開發(fā)出來。這些計算學方法都需要比較不同細胞類型下增強子附近調控信號的分布模式來預測增強子與基因的關系。

最早被應用于預測增強子與基因調控關系的特征就是基因與增強子間的基因組距離。在定位一個增強子位置后，在基因組上距離其最近的基因被認為是該增強子的調控基因。由于增強子本身具有超遠距離調控的性質，這種預測方法的準確率通常不高且變化幅度很大，錯誤發(fā)現率（False Discovery Rate，FDR）約為40%～73%。由于增強子是對基因表達起增強調控作用，為了提高預測的準確性，研究人員將增強子的調控基因定位為距離其最近的表達基因。這種方案需要用到基因表達數據，其準確性仍然較低，FDR值約為53%～77%。

Ernst等人[32]考察了人類9種細胞系中增強子附近的組蛋白修飾數據H3K4me1，H3K4me2和H3K27ac。通過對125 kb距離內基因的RNA-seq表達數據進行關聯分析，尋找具有共同變化模式的“增強子-基因”對，來預測增強子的作用位點。這種預測方法使用了增強子的組蛋白修飾數據作為特征與基因表達數據關聯，能夠一定程度提高預測的準確度。但由于距離的限制只能預測增強子附近125 kb范圍內的作用位點。

這種預測方法使用了RNA pol II作為基因啟動子區(qū)域的標志，使用H3K4me1作為增強子區(qū)域的標志，同時使用H3K27ac作為轉錄活躍區(qū)的標志，通過關聯分析，得到增強子與啟動子共有的組蛋白修飾變化模式，以此說明二者存在關聯關系。使用組蛋白修飾數據能夠避免上述依賴表達量方法只能預測處于活躍狀態(tài)基因的問題。但是由于組蛋白修飾數據本身在基因組中十分廣泛，因此預測精度也會受到一定限制。

Andersson等人[30]使用了CAGE數據來預測增強子的作用位點。通過CAGE可以測得增強子和基因TSS的表達量，選取距離在500 kb范圍內表達量在1 TPM以上的增強子和啟動子，計算二者的皮爾森相關系數并進行假設檢驗。由于上文已經闡述了增強子能夠通過轉錄產生eRNA對目標基因起調控作用，因此可以用二者表達量的相關性來預測關聯關系。這種基于表達量的方法預測增強子作用位點的優(yōu)點是能夠反映活躍增強子與其調控基因的相關性，但同時有很多增強子的表達量較低、甚至沒有表達，這些增強子的作用位點就難以用基于表達量的方法預測，同時500 kb的距離也限制了預測的準確度。

Corradin等人[36]和Factor等人[37]分別開發(fā)了PreSTIGE和PreSTIGEouse來預測人類和小鼠中增強子的作用位點。這兩種方法都使用了組蛋白修飾數據H3K4me1來標識增強子的位置。通過分析與附近基因的表達量相關性確定關聯關系。與以往固定距離方法不同，Corradin等人[36]使用了轉錄因子CTCF的位置數據作為確定增強子與基因間距離的參考。CTCF是與隔離子活性相關的轉錄因子，在基因組中起分割作用。增強子只能在隔離子分割的區(qū)域內對基因的表達起增強作用。與將最近基因作為增強子作用位點的方法相比，使用CTCF數據可以有效降低FDR，其值為13%～23%。這種方法能夠一定程度避免由于距離的不確定性導致預測性能較低的現象。缺點是由于只使用了一種組蛋白修飾數據作為增強子的標識，導致預測結果的準確性仍有一定的不足。

He等人[38]開發(fā)了IM-PET，應用多種遺傳特征的組合來預測增強子的作用位點。研究中根據增強子附近不同遺傳特征的類型將所有特征分為4個類別，對此可做闡釋分述如下。

（1）是反映增強子與啟動子表達活躍度的相關性特征。首先通過組蛋白修飾數據H3K4me1、H3K27ac和H3K4me3估計增強子的表達活性，然后與啟動子的RNA-seq數據進行關聯分析，計算皮爾森相關系數作為第一類特征，簡稱EPC。

（2）是反映轉錄因子與目標啟動子關聯關系的特征。由于第一類特征只能反映在DNA序列層次上的調控，沒有反映在轉錄因子層次上的調控關系，因此需要構建轉錄因子在增強子區(qū)域的結合度與基因表達的關聯關系。通過計算二者的皮爾森相關系數作為第二類特征，簡稱TPC。

（3）是反映啟動子和增強子的保守性的特征。由于啟動子和增強子作為調控區(qū)域的保守性在序列層次上可能不強，但在同線性的層次上卻有著較高的保守性，因此可以分別計算一定距離內啟動子和增強子區(qū)域在多物種中的保守性得分，將得分標準化后的乘積作為第三類特征，簡稱COEV。

（4）是反映啟動子和增強子間距離遠近的特征。即轉錄起始位點到增強子中心的距離作為第四類特征，簡稱DIS。

在完成特征集合的構建后，根據已有的訓練樣本集訓練隨機森林分類器。然后將此分類器應用到測試樣本集上檢測性能調整分類器參數。最后對給定的增強子-啟動子對數據，應用分類器來預測二者的關聯性。圖6顯示了應用IM-PET預測增強子與啟動子關聯關系的流程圖。

IM-PET綜合使用了多種特征來分析和預測增強子與啟動子間的關聯關系。比起前人單純使用一種或幾種特征能夠從生物學角度更加全面地描述強子與啟動子間的關系。同時由于使用了機器學習的方法對分類器進行訓練，使得FDR大大降低（約1%），并且可分析的基因組距離大大增加（2 Mb），有效提高了預測精度。但是由于預測方法中對于特征集合的構建使用了較多的特征，并且缺少對這些特征重要程度的描述，使得一些與預測關聯性不強的特征也納入進來，預測結果也會受到一定影響。

以上從計算學的角度總結了預測增強子作用位點的方法。這些方法大多圍繞著提取增強子與啟動子附近的相關特征，構建特征值間的關聯關系來預測增強子的作用位點?；谟嬎銓W的方法能夠高效經濟地識別潛在的增強子與基因的相互作用關系，但是對于增強子與啟動子的反式作用則顯得乏力。這些應用特定細胞條件下特征一致性變化的預測方法難以實現對所有類型細胞中均表達的管家基因的預測。因此，這些計算學的方法都給出了生物實驗驗證增強子與啟動子的關聯關系。

4結束語

增強子是基因表達調控的重要元件之一。對于增強子本身的識別及其作用位點的預測一直是相關領域的研究熱點問題。近年來生物數據監(jiān)測技術的不斷進步帶來了海量的生物數據，同時生物信息技術的發(fā)展為研究增強子的生物學功能提供了強大的技術手段。本文總結了目前生物信息領域對增強子相關問題的研究熱點，著重總結了增強子及其作用位點預測的研究方法。

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