刁 菁，王友紅，王淑嫻，于曉清，許 拉，王曉璐，李 樂，蓋春蕾，葉海斌，樊 英

(山東省海洋生物研究院，山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266104)

0 引言

隨著我國海水魚工業(yè)化養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，集約化的生產(chǎn)方式和養(yǎng)殖環(huán)境的惡化，導(dǎo)致魚類病害種類增多、暴發(fā)頻率升高、危害程度加重，成為制約我國魚類養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要因素之一[1]。應(yīng)用抗生素、消毒劑等化學(xué)藥物是水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中病害防控的重要手段，但是其弊端也日益顯現(xiàn)：化學(xué)藥物的大量使用不僅會造成水產(chǎn)品藥物殘留，還能誘導(dǎo)病原微生物產(chǎn)生耐藥性、造成水體污染等[2]。由于魚類發(fā)病原因復(fù)雜，病原混合感染情況日益嚴(yán)重，特別是病毒性疾病暴發(fā)比例升高，傳統(tǒng)的化學(xué)藥物已不能起到有效的防治作用，魚病防治難度不斷加大[3]。為保證魚類養(yǎng)殖業(yè)穩(wěn)定可持續(xù)發(fā)展，滿足消費(fèi)者對綠色水產(chǎn)品的需求，保障養(yǎng)殖環(huán)境的清潔，研篩綠色安全高效的魚病防控藥物十分緊迫。中草藥是自然界中可被人類直接藥用的植物、動物以及礦物等的統(tǒng)稱，在中醫(yī)醫(yī)療中的應(yīng)用具有悠久的歷史，其天然高效、無殘留、無毒副作用、無耐藥性等特點(diǎn)引起人們的廣泛關(guān)注[4-5]。近年來，中草藥作為飼料添加劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疾病防治中的應(yīng)用日益廣泛，不僅顯示出良好的抗菌、抗病毒和殺蟲特性，還具有提高機(jī)體免疫力、促生長、抗應(yīng)激、提高繁殖力等多種功效[6-9]。Wu等[10]研究發(fā)現(xiàn)苦參Sophoraflavescens醇提取物能提高尼羅羅非魚Oreochromisniloticus血清中溶菌酶活性，促進(jìn)其非特異性免疫反應(yīng)，顯著增強(qiáng)其對鏈球菌的抗病能力；Haetrakul等[11]發(fā)現(xiàn)在鯉魚Cyprinuscarpio感染鯉皰疹病毒3型(CyHV-3)前后注射鱷嘴花Clinacanthusnutans葉片醇提取物具有顯著的抗病毒作用；張耀武等[12]將黃芪、茯苓、金銀花等組成的中草藥復(fù)方經(jīng)水煎及超微粉碎后添加在飼料中連續(xù)投喂60 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加0.5%的復(fù)方中草藥制劑對黃顙魚的生長、血細(xì)胞的吞噬活性、溶菌酶活力影響顯著。牙鲆Paralichthysolivaceus是我國北方海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類的重要代表種。牙鲆養(yǎng)殖過程中的疾病種類多，在苗種培育及養(yǎng)成期均有發(fā)生，使牙鲆養(yǎng)殖業(yè)遭受巨大經(jīng)濟(jì)損失[13]。本研究基于中草藥藥物功效與配伍原則，研制出一種中草藥復(fù)方免疫增強(qiáng)劑，通過投喂試驗(yàn)研究其對牙鲆抗細(xì)菌感染的效果，同時(shí)從免疫酶活及免疫基因水平分析復(fù)方中草藥免疫增強(qiáng)劑對牙鲆免疫力的影響。研究結(jié)果將為海水魚中草藥防病技術(shù)研究提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及試驗(yàn)動物

致病性遲鈍愛德華氏菌Edwardsiellatarda由山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從患病牙鲆中分離保存；健康牙鲆購自日照某養(yǎng)殖場，體長約(13±1) cm，體重(30±5) g。

1.1.2 試劑和耗材

中草藥復(fù)方(YLK)由山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室根據(jù)中草藥的藥物功效和配伍原則研發(fā)，配方主要包括黃芪、茯苓、黨參、蒲公英、魚腥草、白花蛇舌草、金銀花、玉竹、甘草、五味子等，中草藥微粉由山東亞康藥業(yè)股份有限公司加工制備，粉碎粒度為80%，通過200目篩；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒均購于TaKaRa公司；胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；免疫相關(guān)酶活性測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；其他試劑購自上海生工生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 中草藥投喂試驗(yàn)

選取240尾健康牙鲆，隨機(jī)分成3組，每組80尾，分別飼養(yǎng)于3 m3水槽內(nèi)，連續(xù)充氧，每天換水1次，養(yǎng)殖水溫(21±1)℃，暫養(yǎng)15 d后開始投喂試驗(yàn)，投喂配合顆粒飼料。其中，實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2拌飼投喂中草藥復(fù)方Y(jié)LK微粉，按每公斤配合顆粒飼料分別添加10 g和30 g配置成1%(W∶W)和3%(W∶W)的中草藥飼料，對照組僅投喂配合顆粒飼料，每日早晚各投喂1次，投餌量為魚體重的4%，連續(xù)投喂30 d。

1.2.2 攻毒和取樣

將遲鈍愛德華氏菌接種于TSB中，28℃培養(yǎng)12 h后，6 000 r/min離心10 min收集沉淀，用0.9%無菌生理鹽水洗2遍，將細(xì)菌重懸并調(diào)整濃度為5×107CFU/mL (10倍菌株半致死濃度)，對投喂后31 d的各實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行攻毒處理，每尾魚經(jīng)腹腔注射0.1 mL菌懸液。攻毒后各實(shí)驗(yàn)組魚分別平均分為兩組，每組40尾，其中一組用于觀察魚體死亡情況，另外一組用于組織取樣。取樣組在攻毒前及攻毒后6，12，24，48，72 h分別取魚體的脾臟，在攻毒前及攻毒后24 h和72 h取魚血清，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組取3尾魚。血清的取樣方式為尾靜脈取血，室溫放置2 h后，轉(zhuǎn)入4℃過夜，次日于4℃下3 000 g離心15 min，取上清-20℃保存；將魚體解剖后用無菌剪刀剪下脾臟并切成0.5 cm小塊置于RNAlater中保存；血清和脾臟分別用于免疫相關(guān)酶活性及免疫相關(guān)基因表達(dá)水平的檢測。攻毒后連續(xù)14 d觀察記錄魚體的累計(jì)死亡情況，并計(jì)算中草藥飼料投喂組的相對保護(hù)率，相對保護(hù)率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組死亡率/對照組死亡率)×100%。

1.2.3 免疫相關(guān)酶活性的測定

利用酶活檢測試劑盒檢測魚體血清中4種非特異性酶活活性，包括血清中堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)、酸性磷酸酶(Acid phosphatase，ACP)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)以及溶菌酶(Lysozyme，LSZ)活性檢測，檢測流程參照南京建成試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 免疫相關(guān)基因表達(dá)水平測定

采用熒光定量PCR檢測免疫相關(guān)基因的應(yīng)答變化。具體方法如下：以RNA提取試劑盒提取不同攻毒組各時(shí)間點(diǎn)牙鲆脾臟組織的總RNA，以High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增牙鲆白介素1β (IL-1β)、白介素6 (IL-6)、TCRα受體及C型溶菌酶的引物(表1)，以延伸因子1α(EF-1α)作為內(nèi)參基因，利用SYBR?Premix Ex TaqTM，在CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(Bio Rad，USA)中進(jìn)行反應(yīng)，所有反應(yīng)均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，熱循環(huán)條件如下：95℃預(yù)變性10 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；應(yīng)用CFX96 Manager軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。以各投喂組攻毒前樣品作為參照，計(jì)算各基因在免疫后不同時(shí)間點(diǎn)的相對表達(dá)量。

表1 本研究所使用的引物及其序列信息

Table 1 Sequences of primers used in this study

引物Primer序列信息 Sequence information (5'→ 3')EF1α FEF1α RCTCGGGCATAGACTCGTGGTCATGGTCGTGACCTTCGCTCIL1β FIL1β RCAGCACATCAGAGCAAGACAACATGGTAGCACCGGGCATTCTIL6 FIL6 RCAGCTGCTGCAAGACATGGAGATGTTGTGCGCCGTCATCTCRα FTCRα RGGTCTGATGCTTCACAGTGTGAGACCGCCGGATCTTTCTTCACtype lysome FCtype lysome RTGTCATTGTGGCGATCAAATGGCTCCGATCCCGTTTGG

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±SDE)表示。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，以P<0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 投喂中草藥YLK對牙鲆血清中免疫相關(guān)酶活性的影響

酶活檢測結(jié)果顯示，在遲鈍愛德華氏菌攻毒后，各實(shí)驗(yàn)組魚體血清中ACP、ALP、SOD和LSZ活性水平均表現(xiàn)出不同程度的升高趨勢(圖1)，攻毒后24 h酶活水平顯著高于攻毒前，其中3%中草藥添加組在感染后24 h和72 h,4種酶的活性水平均顯著高于對照組，而1%中草藥添加組除ALP活性以外，其他3種酶活水平也顯著高于對照組。另外，兩種不同比例中草藥添加組魚體血清中酶活整體上沒有顯著性差異，僅在感染后72 h 3%中草藥添加組的ALP活性顯著高于1%中草藥添加組。

2.2 投喂中草藥YLK對牙鲆脾臟中免疫相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

熒光定量PCR檢測結(jié)果如圖2顯示，各投喂組牙鲆在遲鈍愛德華氏菌攻毒后，脾臟組織中4種免疫相關(guān)基因表達(dá)量整體上均出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，而兩個(gè)不同比例中草藥添加組牙鲆在免疫后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)水平均高于單獨(dú)投喂飼料組的牙鲆。其中，投喂中草藥組能較強(qiáng)地誘導(dǎo)IL-1β基因的表達(dá)，在攻毒后48 h表達(dá)量達(dá)到最高值，且顯著高于對照組，然后逐漸下調(diào)；IL-6基因在攻毒后72 h內(nèi)均呈現(xiàn)顯著的上調(diào)表達(dá)，其中對照組和1%中草藥添加組在攻毒后24 h達(dá)到最大值，3%中草藥添加組在攻毒后48 h達(dá)到最大值，然后出現(xiàn)緩慢下調(diào)；TCRα基因和C型溶菌酶基因在攻毒后72 h內(nèi)均發(fā)生上調(diào)表達(dá)，分別在攻毒后48 h和24 h達(dá)到最高值，然后緩慢下降，且投喂中草藥組顯著高于單獨(dú)投喂飼料組。比較兩個(gè)中草藥添加組牙鲆脾臟組織中4種免疫相關(guān)基因表達(dá)量，3%中草藥添加組比1%中草藥添加組更能誘導(dǎo)更高水平的基因表達(dá)。

2.3 投喂中草藥YLK對牙鲆抗遲鈍愛德華氏菌感染能力的影響

攻毒試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同投喂組牙鲆在注射感染遲鈍愛德華氏菌后，均出現(xiàn)不同程度的死亡情況(圖3)，其中對照組在感染后12 d達(dá)到死亡高峰，累積死亡率為95%，3%中草藥添加組和1%中草藥添加組分別在感染后10 d和11 d達(dá)到死亡高峰，累積死亡率分別為62.5%和70%。通過公式計(jì)算，添加3%中草藥和1%中草藥對牙鲆抗遲鈍愛德華氏菌感染的相對保護(hù)率分別為34.2%和26.3%。

不同字母標(biāo)注代表組間存在顯著性差異(P<0.05)

Different letters indicates the significant difference between two groups (P<0.05)

圖1 中草藥YLK對血清中非特異免疫酶活性的影響

Fig.1 The effect of Chinese herbal formula YLK on non-specific enzyme activity in sera

圖2 中草藥YLK對脾臟中免疫相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

圖3 不同投喂組在遲鈍愛德華氏菌攻毒后的累積死亡率

Fig.3 The cumulative mortality rates of Japanese flounders challenged withEdwardsiellatarda

3 討論

3.1 中草藥YLK對牙鲆血清非特異免疫功能的影響

魚類屬于較低等的脊椎動物，非特異性免疫是其抵抗疾病的重要屏障，當(dāng)非特異免疫力降低時(shí)，魚類疾病發(fā)生概率大大增加。魚類血清中的溶菌酶(LSZ)、酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(ALP)以及超氧化物歧化酶(SOD)等活性酶類，是其重要的體液免疫因子，也是反映魚類非特異免疫力的重要指標(biāo)。LSZ廣泛存在于魚類黏液、組織器官分泌液、血清以及吞噬細(xì)胞溶酶體中，能水解細(xì)菌細(xì)胞壁中的肽聚糖導(dǎo)致細(xì)菌溶解，還具有激活補(bǔ)體作用，在抗感染免疫過程中具有重要的作用[14]；ALP和ACP是吞噬細(xì)胞溶酶體酶的重要組成部分，其水解作用可以將病原體破壞降解，在非特異細(xì)胞免疫中發(fā)揮作用[15]；SOD則是魚體抗自由基損傷的關(guān)鍵抗氧化酶，在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用，能夠指示魚體的整體免疫功能[16]。已有研究表明，不同的中草藥配方拌飼投喂魚體均能不同程度地提高魚體的非特異性酶活水平。李霞等[17]投喂添加含黃芪、白術(shù)、防風(fēng)、百部、仙鶴草、土茯苓等復(fù)方中草藥后，牙鲆Paralichthysolivaceus堿性磷酸酶活性和溶菌酶活性含量隨中草藥添加濃度和投喂時(shí)間的增加而增多；Wu 等[18]發(fā)現(xiàn)在飼料中添加車前草和魚腥草可有效提高軍曹魚Rachycentroncanadum超氧化物歧化酶活性、活性氧生成及溶菌酶活性等非特異性免疫指標(biāo)。Chen 等[19]發(fā)現(xiàn)黃連素可使團(tuán)頭魴Megalobramaamblycephala的酸性磷酸酶、溶菌酶活性和補(bǔ)體 C3含量等免疫指標(biāo)明顯提高。白東清等[20]研究表明長期連續(xù)投喂適宜水平的黃芪多糖能有效地促進(jìn)黃顙魚Pelteobagrusfulvidraco體內(nèi) SOD、LSZ活力。本研究也同樣發(fā)現(xiàn)，中草藥YLK投喂組牙鲆在人工感染遲鈍愛德華氏菌后血清中ACP、ALP、SOD和LSZ活性水平顯著高于對照組水平，表明本研究研制的中草藥配方Y(jié)LK可顯著提升牙鲆的非特異免疫水平。然而不同中草藥添加組之間沒有顯著性差異，說明在飼料中添加1%中草藥即能較好地激活和提高魚體免疫酶及抗氧化酶活性，增強(qiáng)魚體非特異免疫功能。

3.2 中草藥YLK對牙鲆免疫相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

病原在入侵魚體后會引起免疫相關(guān)基因的上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，基因表達(dá)水平的高低能夠反映魚體的免疫應(yīng)答水平，可作為疫苗及免疫增強(qiáng)劑效果評價(jià)的重要指標(biāo)。例如，白細(xì)胞介素家族是由單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及其他細(xì)胞所產(chǎn)生的一類非常重要的細(xì)胞因子，IL-1β 作為 IL 家族重要的一員，是最早表達(dá)的一類炎性細(xì)胞因子，它能誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞的生長以及分泌一些細(xì)胞因子來增強(qiáng)免疫應(yīng)答，起到抗細(xì)菌、病毒、腫瘤的作用;IL-6是一種功能廣泛的多效性細(xì)胞因子，可調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的增殖與分化，具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、急性期反應(yīng)及造血功能，在機(jī)體的抗感染免疫反應(yīng)中起重要作用[21-22]。T細(xì)胞受體(TCR)是T細(xì)胞的表面標(biāo)志，作為T細(xì)胞識別和結(jié)合內(nèi)/外源性抗原的表面分子，TCR在免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用[23]。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)脂多糖與β葡聚糖對遲鈍愛德華氏菌亞單位疫苗具有免疫促進(jìn)效果，能夠顯著上調(diào)免疫后牙鲆脾臟組織中IL-1β、IL-6、TCRα及C型溶菌酶等6種免疫相關(guān)基因表達(dá)量[24]；石和榮等[25]在投喂的基礎(chǔ)飼料中添加由板藍(lán)根、黃芩、黃芪、忍冬藤、白芷和甘草組成的復(fù)合中草藥添加劑，可以提高虎龍雜交石斑魚腎臟和脾臟中白細(xì)胞介素 β(IL-1β)、干擾素 γ(IFN-γ)和熱休克蛋白 70(HSP70)免疫相關(guān)基因的表達(dá)量；高風(fēng)英等[26]利用生物素標(biāo)記基因檢測羅氏沼蝦溶菌酶基因表達(dá)產(chǎn)物含量，結(jié)果表明經(jīng)弧菌感染后，溶菌酶基因多個(gè)靶器官的表達(dá)量均比未經(jīng)感染弧菌的羅氏沼蝦高，說明病原菌感染可使體內(nèi)溶菌酶基因轉(zhuǎn)錄量增加，溶菌酶基因在非特異性免疫中有著直接作用。本研究發(fā)現(xiàn)各投喂組牙鲆在遲鈍愛德華氏菌攻毒后，脾臟組織中4種免疫相關(guān)基因表達(dá)量整體上均出現(xiàn)不同程度的上調(diào)，而兩個(gè)中草藥投喂組牙鲆在免疫后多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)水平均顯著高于單獨(dú)投喂飼料組的牙鲆，說明添加的中草藥制劑能顯著提升牙鲆的免疫應(yīng)答水平，而其與魚體的抗病能力存在密切相關(guān)性。

3.3 中草藥YLK對牙鲆抗病原菌感染能力的提升

將不同功效的中草藥依據(jù)中醫(yī)理論配伍形成的中草藥復(fù)方制劑，可以通過協(xié)同作用表現(xiàn)出殺滅病原、增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能、抗炎和抗應(yīng)激以及補(bǔ)充營養(yǎng)促進(jìn)生長等多重功效，從而對水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疾病的預(yù)防和治療發(fā)揮作用。李超等[27]研究發(fā)現(xiàn)在基礎(chǔ)飼料中添加由黃芪、黨參、板藍(lán)根、大黃等組成的中草藥復(fù)方制劑投喂草魚后，其吞噬細(xì)胞活力、血清溶菌活力、血清抗菌活力等均顯著升高，草魚對多子小瓜蟲及嗜水氣單胞菌的抗感染能力均得到提升；馬愛敏等[28]用分別含連翹、豬苓、黃芩、茯苓和黃連水提取物的配合餌料飼喂美國紅魚Sciaenopsocellatus，其結(jié)果表明投喂含有黃芩和茯苓的藥餌可使美國紅魚的體長增長率和相對增質(zhì)量率顯著提高，美國紅魚血液白細(xì)胞的吞噬活性和血清溶菌酶活性顯著提高，利用哈維氏弧菌Vibrioharveyi人工感染美國紅魚后黃芩組的相對免疫保護(hù)率最高達(dá)88.9%。本研究基于藥物特性和中藥配伍法則，選取補(bǔ)益類中草藥黃芪、茯苓、黨參等及清熱解毒類中草藥蒲公英、魚腥草、白花蛇舌草、金銀花等，形成1種復(fù)方中草藥免疫增強(qiáng)劑YLK，研究發(fā)現(xiàn)通過拌飼投喂YLK，可顯著降低牙鲆感染遲鈍愛德華氏菌后的死亡率，顯示出良好的免疫保護(hù)效果，且隨著中草藥添加量的增加，免疫保護(hù)效果更優(yōu)。結(jié)合本研究對于牙鲆血清免疫相關(guān)酶活性及免疫相關(guān)基因表達(dá)水平的檢測結(jié)果，分析中草藥YLK中的活性成分可能通過直接的抗菌作用、增強(qiáng)單核細(xì)胞或中性粒細(xì)胞的吞噬功能、促進(jìn)溶菌酶的分泌及活力、促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及抗炎促消化等作用，提高牙鲆非特異性免疫功能，增強(qiáng)魚體對病原的防御力。然而，目前對于中草藥作用機(jī)理的深入研究不足，缺少完善的中草藥研篩技術(shù)體系，限制中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害中的精準(zhǔn)研發(fā)。大力開展中草藥活性成分功能分析以及中草藥與水產(chǎn)養(yǎng)殖動物機(jī)體間的相互作用機(jī)理研究，將有力推動中草藥在水產(chǎn)病害防治領(lǐng)域發(fā)展應(yīng)用。

4 結(jié)論

中草藥作為中國傳統(tǒng)瑰寶，具有天然、高效、毒副作用小、抗藥性不顯著、資源豐富等優(yōu)點(diǎn)，兼有藥性和營養(yǎng)性，是替代抗生素解決目前水產(chǎn)養(yǎng)殖病害問題的有效途徑之一，已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)病害防治領(lǐng)域。本研究根據(jù)中藥藥理作用，研制出一種中草藥復(fù)方免疫增強(qiáng)劑，通過投喂試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其具有明顯的免疫增強(qiáng)效果，能顯著提高牙鲆抗遲鈍愛德華氏菌感染能力，研究結(jié)果將為水產(chǎn)養(yǎng)殖中草藥防病技術(shù)研究提供重要參考。