陳 俊 陸園園*

（ 中國藥科大學生命科學與技術學院，江蘇 南京211198）

真菌次級代謝產(chǎn)物主要有聚酮類、生物堿類、萜類、肽類和其他類化合物[1]，在不同的發(fā)酵策略下可能會發(fā)酵不同的次級代謝產(chǎn)物。 本研究首次報道通過白光光照一株籃狀菌， 可以穩(wěn)定發(fā)酵出一種聚酮化合物Rugulosin，為進一步研究其次級代謝產(chǎn)物生物學活性以及合成通路提供化合物基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株

真菌SP14 由中國藥科大學海洋藥學教研室保存。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)：將馬鈴薯淀粉1g, 葡萄糖4 g 溶于200ml 水中，121℃滅菌20 min。 淺層大米固體培養(yǎng)基：50ml 玻璃錐形瓶中加入10g 大米和10ml 水，121℃滅菌20 min。

1.3 分子學鑒定

以真菌SP14 基因組DNA 為模板， 使用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTA TTGATATGC-3′)擴增5.8S rDNA 序列。 PCR 使用50ul 反應體系， 反 應 條 件 為95℃預 變 性3min，95℃變 性15s，56℃退 火15s，72℃延伸30s，共35 個循環(huán)，最后72℃延伸5min。PCR 產(chǎn)物使用2%凝膠電泳驗證純化，回收測序。將測序結果進行Blast 比對，使用Mega-X 軟件，采用鄰接法（ Neighbor-Joining，NJ）構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

挑取活化的真菌SP14 接種到含200ml PDA 的500 ml 錐形瓶中，28℃，200rpm 震蕩培養(yǎng)4 天得種子液，吸取2ml 種子液接種在淺層大米固體培養(yǎng)基上，設置光照組與避光組。 光照組：每組3 個平行培養(yǎng)瓶。 避光組：每組3 個平行培養(yǎng)瓶，使用避光錫箔紙包裹。 將兩組培養(yǎng)瓶置于28℃恒溫光照培養(yǎng)箱中，每24小時觀察取樣，HPLC 檢測，第三天至至七天每天取樣，第7 天至第17 天間隔取樣。光照培養(yǎng)箱的光照功率為48w。HPLC 分析條件為：流速為1ml/min，流動相乙腈和水分別添加0.1%甲酸。梯 度 洗 脫 程 序 為：0-5 min，5%乙 腈；5-25min，5-100%乙 腈；25-26min，100-5%乙腈；26-30min，5%乙腈（ 下同）。

1.5 活性產(chǎn)物分離純化

將真菌SP14 種子液接種在1kg 淺層大米固體培養(yǎng)基上，28℃。 光照培養(yǎng)20 天。 發(fā)酵結束后，使用乙醇超聲提取3 次，合并減壓濃縮得到粗提物浸膏。 粗提浸膏經(jīng)過大孔吸附樹脂柱層析粗分， 依次用純水，20%，40%，60%，80%，100%乙醇水梯度洗脫，HPLC 檢測其主要富集在60%組分（ 1.036g）；將60%組分減壓濃縮后使用ODS 層析柱分離， 依次用20%，40%，60%，80%，100%甲醇水梯度洗脫，HPLC 檢測其主要在80%-2 組分（ 47.8mg）；將上述組分減壓濃縮后使用Sephadex LH-20 凝膠分離，流動相為甲醇，用試管分管收集后使用HPLC 檢測純度后合并減壓濃縮得黃色化合物(17.6mg)。

2 結果與分析

2.1 真菌種屬鑒定

PCR 產(chǎn)物條帶單一，經(jīng)測序，其分子量大小為580bp。將序列上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫進行Blast 比對，選取同源性較高的7 條序列構建系統(tǒng)進化樹，結果顯示，真菌SP14 與兩株籃狀菌聚為一支且這兩支分支的同源性較高， 確定真菌SP14 為Talaromyces Rugulosin SP14（ 圖1，2）。

2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

在以活性為指標的真菌篩選中，發(fā)現(xiàn)Talaromyces Rugulosin SP14 上下層培養(yǎng)基顏色不一（ 上黃下青），推測光照可能影響了真菌SP14 的次級代謝產(chǎn)物譜。 以光照為變量，進行光照和避光培養(yǎng)。 結果顯示， 光照組于第三天觀察到黃色化合物， 同時HPLC 顯示，與避光組相比，在保留時間22.3 min 處，光照組檢測出一個特征峰， 且隨著發(fā)酵時間的延長而變成主要次級代謝產(chǎn)物，而避光組在此保留時間則沒有特征峰出現(xiàn)，結合培養(yǎng)基顏色狀態(tài)及HPLC 檢測曲線，確定該黃色化合物為活性化合物（ 圖3）。

圖1 Lane1：2 K Marker; Lane2：5.8S rDNA

圖2 SP14 系統(tǒng)進化樹

圖3 光照與避光組HPLC 檢測曲線（ D-Dark L-Light）

2.3 化合物結構鑒定

黃色化合物：固體，易溶于DMSO，分子式為C30H22O10。1H-NMR (500MHz，DMSO-d6)，δ：14.60(2H，brs，1-OH，1'-OH)，2.76(2H，d，J=5.17Hz，H-2，H-2')，4.41(2H，s，H-3，H-3')，5.40(2H，brs，3-OH，3'-OH)，3.38(2H，brs，H-4，H-4')，7.45(2H，d，J=1.2Hz，H-6，H-6')，7.18 (2H，d，J=1.2Hz，H-8，H-8')，11.58 (2H，s，9-OH，9'-OH)，2.42 (6H，s，H-15，H-15')。 13C-NMR (500MHz，DMSO-d6)，δ：186.0(C-1，C-1')，58.4(C-2，C-2')，68.5(C-3，C-3')，47.8 (C-4，C-4')，55.6 (C-5，C-5')，120.4 (C-6，C-6')，147.4(C-7，C-7')，123.9 (C-8，C-8')，160.2 (C-9，C-9')，114.2(C-10，C-10')，180.6(C-11，C-11')，106.0(C-12，C-12')，194.0(C-13，C-13')，131.9(C-14，C-14')，21.4(C-15，C-15')。 以上數(shù)據(jù)與文獻中[2]報道基本一致，確定其為Rugulosin。

3 討論

本文研究了從南極海泥中分離篩選出來的一株籃狀菌Talaromyces Rugulosin SP14， 通過白光光照穩(wěn)定了活性次級代謝產(chǎn)物的發(fā)酵并從其固體發(fā)酵物中分離出來一種活性次級代謝產(chǎn)物Rugulosin，文獻報導，該化合物對MRSA 有比較好的抑菌活性[2]，其MIC 值為0.125ug/ml。 Rugulosin 最先自Penicillium rugulosum 菌中分離出來，前期研究顯示，Rugulosin 對HIV 病毒有抑制作用[3]，并且對鏈球菌及棒狀桿菌有很強的抑制活性，并能引起枯草芽孢桿菌DNA 損傷，但對革蘭氏陰性菌抑制作用較小[4]，對大鼠肝臟和大腸桿菌的核糖核酸聚合酶以及大鼠肝臟和梨形四膜蟲的核糖核酸酶H 也有比較強烈的抑制作用[5]。 部分研究顯示，真菌來源的Rugulosin 對熱休克蛋白90(Hsp90)的三磷酸腺苷酶(ATPase)活性有較強的抑制作用，分子對接顯示，Rugulosin 與Hsp90 N 端之間存在較強的相互作用，二者通過氫鍵形成靜態(tài)復合物同時可以使Hsp90 N 端的α- 螺旋含量下降3.4%，從而使Hsp90 N 端的二級結構發(fā)生改變[6]。 在一些腫瘤細胞中，Hsp90 可以維持較高的表達量，繼而影響多種腫瘤相關蛋白，如Bcr-abl，Akt，C-Raf，CDK4 以及Her2 等的表達[7]，所以Hsp90 抑制劑可以作為抗腫瘤細胞的先導化合物，因此有潛力進一步將Rugulosin 開發(fā)成為分子探針去研究與Hsp90 相關的信號通路[8]。 此外Rugulosin 作為一種真菌毒素，已被ABcam公司開發(fā)為RNA 聚合酶的小分子抑制劑。 在農(nóng)業(yè)應用上，Rugulosin 具有抗菌和殺蟲活性，在一些植物內(nèi)生真菌的次級代謝產(chǎn)物中也發(fā)現(xiàn)有Rugulosin 的存在，因此將其用作一種生物殺蟲劑，以減少化學殺蟲劑的使用，是一種環(huán)境友好型的生物殺蟲劑[9]。

本研究首次報道了白光光照對籃狀菌屬真菌活性次級代謝產(chǎn)物的影響， 將避光粗提物置于光照培養(yǎng)箱中光照刺激，HPLC沒有檢測出Rugulosin 的存在， 說明其并不是光照催化而形成的，而是由真菌自身代謝形成，其中可能涉及到一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的參與。 真菌可能為適應極地極晝極夜環(huán)境而進化演變出獨特的對光敏感的次級代謝機制，光照因素也為今后研究極地海洋真菌次級代謝產(chǎn)物提供一個新的思路和依據(jù)。