孔令悅 向 華 唐克華 董愛(ài)文 唐忠海

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128； 3. 吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 張家界 427000)

白及多糖(Bettila striata polysaccharde，BSP)為無(wú)味白色細(xì)纖維狀，易溶于熱水，不溶于高濃度有機(jī)溶劑。具有止血[1]、抗腫瘤[2]、抗菌[3]等生物活性。其提取物對(duì)光敏感、易氧化、易醇沉。現(xiàn)有的白及多糖修飾方法主要為通過(guò)有機(jī)酸(膽甾醇琥珀酸、硬脂酸、磷酸、葉酸等)對(duì)其進(jìn)行酯化和醛化等化學(xué)修飾法，該方法降低了白及多糖的還原性。酪氨酸酶是一種氧化酶，可通過(guò)氧化L-多巴的羥基，調(diào)控人體黑色素和瓜果褐變的生成[4]。

脂質(zhì)體是由與皮膚結(jié)構(gòu)相似的雙親性分子組成[5]，可以使白及多糖更好地透過(guò)人體表皮，并在皮膚細(xì)胞中積累，達(dá)到美白效果。試驗(yàn)擬采用納米脂質(zhì)體法制備高含量白及多糖脂質(zhì)體，并研究其對(duì)酪氨酸酶的影響，旨在為白及多糖在美白化妝品、保健食品、食品添加劑等方面的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 材料與試劑

白及塊莖：廣州民信藥業(yè)連鎖有限公司；

酪氨酸酶：上海源葉生物科技有限公司；

辛酸/癸酸甘油三酯PEG-8辛酸/癸酸甘油酯類：廣州市衡拓貿(mào)易有限公司；

鯨蠟硬脂醇聚醚-25：廣州合孚化工有限公司；

月桂醇聚醚-23：廣州市奧源貿(mào)易有限公司；

乙氧基二甘醇：上海蒲恩生化科技有限公司；

PEG-30二聚羥基硬脂酸酯：廣州利美達(dá)進(jìn)出口商貿(mào)有限公司；

辛酸/癸酸甘油三酯：美國(guó)英狄士公司；

1,2戊二醇：廣州艾比特貿(mào)易有限公司；

1,2己二醇：廣州露途化工有限公司；

對(duì)羥基苯乙酮：廣州欣浪生物化工有限公司；

生理鹽水：辰欣藥業(yè)股份有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

中草藥破碎機(jī)：1000Y型，天向九太(大連)商貿(mào)有限公司；

電子分析天平：FA2204N型，上海力辰儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52A型，上海亞榮生化儀器廠；

臺(tái)式離心機(jī)：TGL-16B型，上海圣科儀器設(shè)備有限公司；

紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)：722S型，上海菁華科技儀器有限公司；

電動(dòng)攪拌機(jī)：GZI20型，江陰科研器械有限公司；

均質(zhì)機(jī)：500W型，北京海福達(dá)科技有限公司；

激光粒度儀：3000 HSA型，英國(guó)馬爾文儀器公司；

全自動(dòng)酶標(biāo)儀：MR-96A型，南京貝登醫(yī)療股份有限公司；

熒光分光光度計(jì)：F-380型，天津港東科技發(fā)展股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 白及多糖的提取與純化 采用熱水回流提取法提取、醇沉法純化[6]。

1.2.2 白及多糖脂質(zhì)體的制備 將油相(1%～10%辛酸/癸酸甘油三酯PEG-8辛酸/癸酸甘油酯類、1%～10%鯨蠟硬脂醇聚醚-25、1%～10%月桂醇聚醚-23、1%～10%乙氧基二甘醇、5%～25% PEG-30二聚羥基硬脂酸酯、5%～20%辛酸/癸酸甘油三酯)與水相(水、25%白及多糖)分別加熱至85～90 ℃，12 000 r/min下將油相快速倒入水相中均質(zhì)3 min；攪拌降溫至70 ℃時(shí)加入防腐劑(1, 2戊二醇，1, 2己二醇，對(duì)羥基苯乙酮)，冷卻，即制得25%白及多糖脂質(zhì)體。

1.2.3 透皮滲透行為 豬腹部皮膚(未經(jīng)開(kāi)水燙，去除毛發(fā))裁剪成適當(dāng)大小，皮膚角質(zhì)層朝上，固定于Franz-type擴(kuò)散池中。用去離子水配制0.50 mg/mL白及多糖溶液和100 mg/mL白及多糖脂質(zhì)體溶液。取待測(cè)樣品100 mL均勻涂布于皮膚上，接受池中加入100 mL生理鹽水，37 ℃恒溫水浴并攪拌。分別于涂布后定時(shí)吸取接受液1 mL，采用苯酚—硫酸法測(cè)定白及多糖濃度。待測(cè)樣品為白及多糖脂質(zhì)體、白及多糖，去離子水為對(duì)照。

1.2.4 酪氨酸酶活力及其抑制率的測(cè)定

(1) 白及多糖脂質(zhì)體溶液的配制：將128 mg白及多糖脂質(zhì)體溶于10 mL 0.2 mol/L的磷酸緩沖溶液中，再分別稀釋成6.4，3.2，1.6 mg/mL溶液。

(2) 酪氨酸酶抑制率的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[7]的方法并稍作改動(dòng)。取3 mL 0.2 mol/L的磷酸緩沖溶液于10 mL試管中，加入0.1 mg/mL酪氨酸酶溶液(用0.2 mol/mL pH 7.5的磷酸緩沖溶液溶解)1 mL。加入濃度為12.8，6.4，3.2，1.6 mg/mL的白及多糖脂質(zhì)體溶液各1 mL，混勻，以1 mL磷酸緩沖溶液為空白組，37 ℃孵育30 min。用酶標(biāo)儀測(cè)定OD475 nm值，并按式(1)計(jì)算抑制率。

(1)

式中：

R——酪氨酸酶抑制率，%；

Fco——白及多糖脂質(zhì)體的OD475 nm值；

Fob——空白組的OD475 nm值。

(3) 半抑制濃度的測(cè)定：以白及多糖脂質(zhì)體濃度為橫坐標(biāo)，酪氨酸酶抑制率為縱坐標(biāo)，繪制回歸曲線，并計(jì)算半抑制濃度IC50[8]。

1.2.5 熒光光譜分析 向10 mL試管中加入2 mg/mL的酪氨酸酶溶液1 mL，加入濃度為0.0，1.6，3.2，6.4，12.8 mg/mL的白及多糖脂質(zhì)體溶液各1 mL，混勻，分別加入20，15，10，5 mg多巴粉末，用3 mL磷酸緩沖溶液(0.2 mol/L)進(jìn)行溶解。37 ℃孵育30 min，于熒光分光光度計(jì)上進(jìn)行熒光譜掃描和測(cè)定。光譜條件：掃描溫度25 ℃，激發(fā)波長(zhǎng)295 nm，掃描范圍295～400 nm，激發(fā)狹縫2.5 nm，掃描速度240 nm/min，發(fā)射狹縫2.5 nm。

1.2.6 熒光猝滅機(jī)制分析 按式(2)確定熒光猝滅類型。

Fo/Fc=1+Ks[Q]=1+Kqτ0[Q]，

(2)

式中：

Fo——熒光體不含抑制劑時(shí)的最大熒光強(qiáng)度；

Fc——熒光體含白及多糖脂質(zhì)體的最大熒光強(qiáng)度；

Ks——Stern-Volmer猝滅常數(shù)；

[Q]——抑制劑濃度，mg/mL；

Kq——雙分子猝滅過(guò)程速率常數(shù)，L/mol；

τ0——生物大分子的熒光壽命，約為10-8s。

當(dāng)小分子與大分子結(jié)合時(shí)，其結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n與結(jié)合常數(shù)Ka按式(3)計(jì)算。

lg[(Fo-Fc)/Fc]=nlgKa-nlog{1/〔[Qd]-(Fo-Fc)[Qp]/Fo〕}，

(3)

式中：

n——藥物小分子與生物大分子相互作用的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)；

Ka——結(jié)合常數(shù)，L/(mol·s)；

[Qd]——猝滅劑濃度，mg/mL；

[Qp]——L-多巴濃度，mg/mL。

1.2.7 紫外光譜分析 取濃度為2 mg/mL的酪氨酸酶溶液1 mL，加入濃度為12.8 mg/mL的白及多糖脂質(zhì)體溶液1 mL，用磷酸緩沖溶液補(bǔ)齊使溶液總體積為5 mL，混勻，37 ℃孵育30 min，空白組為不加白及多糖脂質(zhì)體，于420～500 nm處進(jìn)行紫外吸收光譜掃描。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 采用Origin 6.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 穩(wěn)定性

白及多糖脂質(zhì)體為半透明液體、無(wú)味，3 000 r/min離心30 min未出現(xiàn)分層現(xiàn)象。28 d耐熱/耐寒試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，白及多糖脂質(zhì)體未出現(xiàn)變色、變味、分層、渾濁等異?，F(xiàn)象，自然光照條件下連續(xù)放置28 d也未出現(xiàn)變色、變味、分層、渾濁等異?，F(xiàn)象。初步判斷制得的白及多糖脂質(zhì)體穩(wěn)定性良好。

2.2 粒徑和包封率

由圖1可知，樣品徑粒分布均勻，分布范圍適當(dāng)。經(jīng)動(dòng)態(tài)光散射處理，制備的脂質(zhì)體平均粒徑為5.72 μm。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體包封率數(shù)據(jù)離散度較小，平均包封率為87.15%，說(shuō)明該工藝重現(xiàn)性良好。

2.3 透皮吸收情況

顆粒進(jìn)入皮膚的方式主要有3種：① 粒徑>10 μm的顆粒不能滲入，保留在皮膚表面；② 粒徑為3～10 μm的顆粒適合滲入皮脂腺—毛囊單元；③ 可通過(guò)在毛干周圍開(kāi)口的毛囊漏斗滲入，粒徑<3 μm的顆?？蓾B入角蛋白細(xì)胞胞間。由圖2可知，當(dāng)透皮吸收時(shí)間為8 h 時(shí)，白及多糖達(dá)最大透過(guò)量，其透皮效果較差。白及多糖脂質(zhì)體粒徑為3～10 μm，顯著增加了白及多糖的透皮滲透效果，其透過(guò)量為白及多糖的3倍，當(dāng)透皮吸收時(shí)間為16 h時(shí)接近最大透過(guò)量，說(shuō)明該脂質(zhì)體已滲入皮脂腺—毛囊中。

圖1 25%白及多糖脂質(zhì)體的粒徑分布圖

Figure 1 Particle size distribution of 25%Bettilastriatapolysaccharde liposomes

2.4 白及多糖脂質(zhì)體對(duì)酪氨酸酶抑制率的影響

由圖3可知，白及多糖脂質(zhì)體對(duì)酪氨酸酶的抑制率隨脂質(zhì)體濃度的增加而增大，且具有一定的線性關(guān)系，當(dāng)白及多糖脂質(zhì)體濃度為2 mg/mL時(shí)，抑制率達(dá)40%，說(shuō)明脂質(zhì)體保留了白及多糖的還原性。白及多糖的IC50為11.56 mg/mL。

圖2 白及多糖及其脂質(zhì)體透皮吸收效果

Figure 2 Transdermal absorption ofBettilastriatapolysaccharde and their liposomes

圖3 白及多糖脂質(zhì)體對(duì)酪氨酸酶抑制率的影響

Figure 3 Inhibition rates of tyrosinase byBettilastriatapolysaccharde liposomes at different concentrations

2.5 紫外吸收光譜分析

由圖4可知，隨著白及多糖脂質(zhì)體含量的增加，酪氨酸酶紫外吸收最大波長(zhǎng)向右偏移，波峰由282 nm漂移至286 nm，屬于紅移，表明該脂質(zhì)體與酪氨酸酶位點(diǎn)結(jié)合，使酪氨酸酶發(fā)生了變化。282，286 nm處出現(xiàn)新物質(zhì)，而白及多糖脂質(zhì)體的位于282 nm處，說(shuō)明此處為白及多糖和酪氨酸酶的結(jié)合物。

2.6 熒光光譜分析

由圖5可知，酪氨酸酶的最大熒光峰出現(xiàn)在334 nm處。加入白及多糖脂質(zhì)體后，酪氨酸酶的熒光強(qiáng)度逐漸降低，說(shuō)明白及多糖脂質(zhì)體對(duì)酪氨酸酶的熒光具有猝滅作用，且猝滅作用隨酪氨酸酶濃度的增加而變強(qiáng)；同時(shí)也表明白及多糖脂質(zhì)體與酪氨酸酶發(fā)生了相互作用，改變了酪氨酸酶構(gòu)象。

圖4 紫外吸收光譜

Figure 4 Ultraviolet absorption spectrum ofBettilastriatapolysaccharde liposomes on tyrosinase

圖5 熒光猝滅圖

Figure 5 Fluorescence quenching of tyrosinase byBettilastriatapolysaccharide liposomes

2.7 白及多糖脂質(zhì)體對(duì)酪氨酸酶的熒光猝滅機(jī)制

以速度倒數(shù)1/v為縱坐標(biāo)，底物濃度倒數(shù)1/[s]為橫坐標(biāo)作LINEWEAVER-BWK雙倒數(shù)法圖如圖6所示。

抑制類型的判斷標(biāo)準(zhǔn)為：① 競(jìng)爭(zhēng)性，Vmax不變，Km值增加；② 非競(jìng)爭(zhēng)性，Vmax增加，Km值不變；③ 混合性，Vmax增加，Km值減??；④ 反競(jìng)爭(zhēng)性：Vmax減小，Km減小。由表1可知，隨著白及多糖脂質(zhì)體濃度的增加，Vmax基本保持不變，Km值逐漸增大，說(shuō)明白及多糖脂質(zhì)體為競(jìng)爭(zhēng)性抑制。白及多糖類似于底物，可與底物競(jìng)爭(zhēng)酪氨酸酶活性中心的結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制酪氨酸酶活性。

圖6 白及多糖脂質(zhì)體對(duì)酪氨酸酶抑制的LINEWEAVER-BWK圖

Figure6 LINEWEAVER-BWK diagram of tyrosinase inhibition byBettilastriatapolysaccharde liposomes

表1 白及多糖脂質(zhì)體抑制酪氨酸酶活性的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

Table 1 Kinetic parameters of the inhibition of tyrosinase activity byBettilastriatapolysaccharide liposomes

濃度/(mg·mL-1)KmVmax0.00.940 50.292 61.61.107 70.307 63.21.270 70.298 46.41.548 30.298 712.81.796 80.289 6

假設(shè)抑制劑對(duì)酪氨酸酶熒光猝滅機(jī)制為動(dòng)態(tài)猝滅，以Fo/Fc為縱坐標(biāo)，白及多糖脂質(zhì)體濃度為橫坐標(biāo)作圖，分析猝滅機(jī)制。

由圖7可知，白及多糖脂質(zhì)體Kq為5×1012L/(mol·s)，各類猝滅劑對(duì)生物大分子的最大擴(kuò)散常數(shù)為2.0×1010L/(mol·s)；白及多糖脂質(zhì)體對(duì)酪氨酸酶的熒光猝滅可能不是通過(guò)擴(kuò)散進(jìn)行的動(dòng)態(tài)猝滅，而是靜態(tài)猝滅，說(shuō)明白及多糖脂質(zhì)體與酪氨酸酶的相互作用為非共價(jià)反應(yīng)，形成了特定結(jié)構(gòu)的化合物。

圖7 白及多糖脂質(zhì)體對(duì)酪氨酸酶熒光猝滅的Stern-Volmer圖

Figure 7 Stern-Volmer diagram of tyrosinase fluorescence quenching byBettilastriata polysaccharide liposomes

由圖8可知，線性方程為y=-1.071 1x+5.160 9，R2=0.999 8，斜率即白及多糖脂質(zhì)體與酪氨酸酶的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n=1.071 1，截距即結(jié)合常數(shù)Ka=6.58×105L/mol。

3 結(jié)論

通過(guò)納米脂質(zhì)體制備技術(shù)制備了白及多糖脂質(zhì)體，其粒徑分布均勻，穩(wěn)定性良好。該脂質(zhì)體保留了白及多

圖8 白及多糖脂質(zhì)體對(duì)酪氨酸酶的雙倒數(shù)圖

Figure 8 Double reciprocal plot of tyrosinase toBettilastriatapolysaccharide liposomes

糖抑制酪氨酸酶活性的特征，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)酪氨酸酶的結(jié)合點(diǎn)(n=1.071 1)，從而抑制酪氨酸酶活性，能有效地滲入皮膚且其輸送能力強(qiáng)于傳統(tǒng)基質(zhì)介質(zhì)的。后續(xù)可利用白及多糖打造新型的保健食品或美白功效的化妝品。